分階段控制溫度提高胞外多糖產量

吳明霞， 趙文凈

（寧德師范學院 生物系，福建 寧德 352100）

分階段控制溫度提高胞外多糖產量

吳明霞， 趙文凈

（寧德師范學院 生物系，福建 寧德 352100）

利用冬蟲夏草頭孢菌發酵生產胞外多糖，研究不同溫度下對菌體生長和胞外多糖產量的影響。結果表明：26℃是菌體生長的最適溫度，28℃是產物積累的最適溫度。在此基礎上，提出分階段控制溫度工藝。通過響應面法分析，得到優化方案為第一階段溫度26℃，變溫時間17 h，第二階段溫度28.5℃，胞外多糖產量10.92 g/L，比28℃恒溫培養提高了25.5%。

分階段控制溫度工藝；胞外多糖；響應面法

微生物胞外多糖是微生物在生長過程中產生的、存在于發酵培養基中的可溶性或不溶性多糖，胞外多糖易與菌體分離，可通過深層發酵實現工業化生產[1]。近年來胞外多糖已發展成為一類新型的發酵產品，除藥用外還可作為增稠劑、懸浮劑和穩定劑，廣泛用于化工、石油開采、醫藥加工、食品[2]和化妝品等領域。

溫度對發酵的影響及其調節控制是影響有機體生長繁殖最重要的因素之一，因為任何生物化學的酶促反應與溫度變化有關。溫度對發酵的影響是多方面且錯綜復雜的，主要表現在對細胞生長、產物合成、發酵液的物理性質和生物合成等方面。一般而言，最適發酵溫度是既適合菌體生長又適合代謝合成的溫度，但最適生長溫度與最適代謝合成的溫度往往是不一致的[3]。目前冬蟲夏草菌絲體[4]發酵溫度的研究大部分處于恒溫培養階段，對于采用分階段控制溫度工藝，提高胞外多糖產量的方法，國內外鮮有報道。作者研究冬蟲夏草菌絲體分階段控制溫度工藝，以期對胞外多糖產量有顯著提高。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種冬蟲夏草頭孢菌。

1.1.2 斜面培養基PDA培養基。

1.1.3 種子培養基（g/L）葡萄糖20，蛋白胨5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.13，麥麩50；pH自然。

1.1.4 發酵培養基（g/L）葡萄糖100，蔗糖20，K2HPO40.15，MgSO4·7H20 0.12；pH自然[5]。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法將菌種接種于PDA斜面上，于24～25℃下恒溫培養5～6 d，菌絲即可長滿斜面；將頂端菌絲體接種于種子培養基中，于24℃搖床160 r/min振蕩培養48 h，備用[6]。

1.2.2 恒溫培養按8%接種體積分數將種子培養基接入裝有100 mL培養基的500 mL三角瓶中，置于25、26、27、28、29℃的160 r/min搖床恒溫振蕩培養48 h，每隔2小時測定菌液的菌體干重及胞外多糖產量。

1.2.3 分階段控制溫度培養按8%接種體積分數將種子培養基接入裝有100 mL培養基的500 mL三角瓶中，置于搖床160 r/min恒溫振蕩培養48 h，每隔2小時測定菌體干重及胞外多糖產量。

1.3 胞外多糖測定方法

采用苯酚-硫酸法[7]。

1.4 菌體干重的測定

取一定量的發酵液，用已烘干并稱重的濾紙過濾，用水清洗至洗液不再帶有發酵液顏色為止。在80℃恒溫的烘箱中烘至恒質量，在干燥器中冷卻至常溫，稱質量。

1.5 響應面法設計

以第一階段溫度、變溫時間、第二階段溫度3個因素對胞外多糖產量的影響并用響應面法進行優化，以胞外多糖產量為響應值，試驗因素編碼及水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.6 數據分析

Design Expert8.0.5.0軟件。

2 結果與分析

2.1 溫度對胞外多糖產量的影響

由圖1a可知，25～29℃菌體生長出現延遲期、對數期、穩定期、衰亡期。培養溫度25℃時，0～16 h為延遲期，菌體生長緩慢；16 h后菌體出現對數期，菌體快速生長；培養溫度29℃時，0～12 h為延遲期，12～36 h為對數期，36 h菌體進入穩定期。在溫度為29℃時，延遲期縮短了4 h，這可能因為溫度過高使菌體生長過快，使菌體提前進入對數期。由于培養溫度26℃時菌體生長最好，因此分階段控制溫度工藝選取菌體生長的最適溫度26℃作為第一階段溫度。

由圖1b所示，在菌體生長的不同階段均有胞外多糖生成，29℃時由于溫度的升高使胞外多糖大量釋放，這可能由于提前進入衰亡期使菌體在穩定期胞外多糖產量下降。而28℃時菌體在穩定期后期胞外多糖產量達到最高，因此分階段控制溫度工藝選取產胞外多糖的適宜溫度28℃作為第二階段溫度。因為胞外多糖在菌體進入對數期開始大量釋放，因此分階段控制溫度工藝選取16 h作為變溫時間。

圖1 溫度對菌體生長（a）和胞外多糖產量（b）的影響Fig.1 Effect of temperature on the bacteria growth and the yield of expolysaccharide

2.2 響應面法優化方案

2.2.1 響應面分析方案及試驗結果試驗因素水平及設計方案見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平及設計方案和結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表2中試驗數據進行二次多項式逐步回歸擬合[8]，得到的數學模型：

由表3可知，模型的可靠性可從方差分析及相關系數來考察。當≥F值小于0.05時，即表示該指標顯著；當P≥F值小于0.001時，即表示該指標極顯著。結果表明：一次項A、B顯著，C極顯著；二次項A2、B2和C2同樣極顯著；交互項AB顯著，AC和BC不顯著，且失擬性p=0.062 7≥0.05，對模型是有利的，無失擬因素存在，因此可用該回歸方程代替實驗真實值進行分析。

表3 回歸統計分析結果Table 3 Regression analysis

通過比較回歸方程中的一次項系數絕對值的大小，可判斷因素影響的大小關系[9]，因此3個因素對胞外多糖產量影響的大小分別為：第二階段溫度≥變溫時間≥第一階段溫度，由以上分析可知，各因素對胞外多糖產量的影響復雜，并非簡單的線性關系。

2.2.3 響應曲面分析和優化通過模型方程所作的響應曲面圖，可直觀地描述各因素對響應值的影響和各個因素間的交互作用。由圖2—4可知，曲面均是開口向下的凸面，其中心位于所考察區域內，說明在考察的區域內存在響應值的極大值，同時響應面為高度卷曲的曲面。圖2—4等高線可直觀反映了兩種因素交互作用對相應值的影響。比較圖形可知，第二階段溫度是影響胞外多糖產量的最顯著因素，表面等高線陡峭；變溫時間次之，第一階段溫度影響最小，表現為等高線平滑，且隨數值的增加而減少，響應值變化較小。

圖2 第一階段溫度和第二階段溫度交互作用對胞外多糖產量的影響Fig.2 Effect of interaction of the first stage temperature and the second stage temperature on the yield of expolysaccharide

圖3 變溫時間和第二階段溫度交互作用對胞外多糖產量的影響Fig.3 Effect of interaction of the second stage temperature and time of variable temperature on the yield of expolysaccharide

圖4 第一階段溫度和變溫時間交互作用對胞外多糖產量的影響Fig.4 Effect of interaction of the first stage temperature and time of variable temperature on the yield of expolysaccharide

通過軟件分析，分階段控制溫度的最佳工藝為：第一階段溫度26.05℃，變溫時間16.84 h，第二階段溫度28.54℃，得到胞外多糖產量11.15 g/L。

為檢驗RSM法的可靠性，采用上述最佳方案提高胞外多糖產量的試驗，同時考慮實際操作的情況，將優化方案修正為第一階段溫度26℃，變溫時間 17 h，第二階段溫度 28.5℃時胞外多糖產量10.92 g/L，與實際值基本吻合，比28℃恒溫培養提高了25.5%。

3 結語

1）菌體生長和產物積累的最適溫度分別為26、28℃。

2）通過響應面法分析，分階段控制溫度的最佳工藝為：第一階段溫度26℃，變溫時間17 h，第二階段溫度28.5℃，胞外多糖產量10.92 g/L，比28℃恒溫培養提高了25.5%。

通過試驗探討響應面法提高胞外多糖產量優化的可行性，結果表明，通過該法優化得到的工藝 基本準確可靠，具有一定的實用價值。

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Two-Stage Temperature Controlling Strategy For Improving the Yield of Expolysaccharide

WU Mingxia， ZHAO Wenjing
（Department of Biology，Ningde Normal University，Ningde 352100，China）

The fermentation production of expolysaccharide from Cordyceps militaris was studied at different temperature.The results showed that the optimal growth temperature was at 26℃and the highest yield of expolysaccharide accumlation temperature was at 28℃.Thus，the two-stage temperature control strategy was developed based on RSM.When pre-fermentation temperature was kept at 26℃for 17 hours and changed to 28.5℃，the yield increased to 10.92 g/L which was 25.5% higher than that of fermentation at single temperature at 28℃.

two-stage temperature control strategy，expolysaccharide，RSM

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）05—0542—05

2014-02-08

福建省教育廳A類項目（JA12341）。

吳明霞（1979—），女，吉林白城人，工學碩士，講師，主要從事微生物代謝調控方面的研究。E-mail：wuming0224@163.com