綠色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降膽固醇作用

劉長建， 劉 秋， 姜 波， 閆建芳， 齊小輝

（大連民族學院 生命科學學院，遼寧 大連 116600）

綠色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降膽固醇作用

劉長建， 劉 秋*， 姜 波， 閆建芳， 齊小輝

（大連民族學院 生命科學學院，遼寧 大連 116600）

從風干香腸中分離得到一株生長良好的乳酸菌ORC4，菌株能產乳酸、革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性。經系統發育分析，結合菌落形態、細胞形態、生化反應試驗，確定菌株ORC4為綠色魏斯氏菌。綠色魏斯氏菌ORC4的完整和破碎細胞對O2-·、DPPH·和·OH的清除率都與細胞濃度呈正相關。在細胞濃度為5×108CFU/mL時，菌株ORC4破碎細胞對O2-·、DPPH·和·OH的清除率都高于完整細胞，分別為45.17%、56.17%和54.01%。菌株ORC4還能清除培養基中最多為

風干香腸；綠色魏斯氏菌；16S rDNA；系統發育樹；抗氧化作用；降膽固醇作用

魏斯氏菌屬（Weissella）與乳桿菌屬十分相似，也是兼性厭氧、觸酶陰性、革蘭氏陽性，但呈鏈狀排列的短桿形或類球形。魏斯氏菌作為乳酸菌廣泛存在于肉制品、泡菜等發酵食品中，通過16S rRNA序列、23S rRNA序列的研究發現，與乳桿菌屬、明串珠菌屬相近的這一個族群應放在屬的分類位置，Collin等提出了魏斯氏菌屬（Weissella）[1]，并在1994年得到確認[2]。當時共有7個種都歸到該屬，包括Niven等1957年從熏肉中分離到的新種，最初命名為Lactobacillus viridescens[3]，而現在命名為Weissella viridescens，是這個屬的第一個被分離的種，并作為該屬的模式菌株。2013年分別從駝螽的消化道[4]、發酵可可豆[5]和發酵的谷物[6]中又分離到3個新種，到現在魏斯氏菌屬共有18個種。

食物發酵的通常乳酸菌屬包括肉食桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、四鏈球菌屬、魏斯氏菌屬[7]。而魏斯氏菌屬是植物發酵初期的優勢菌群，能提供了幾種潛在的保健和營養作用[8]，包括食物的營養價值，控制腸道感染，改善乳糖的消化，控制膽固醇水平，以及多個癌癥的發病[9]。因為乳酸菌的發酵產品能吸收血液中的膽固醇，降低血液中的膽固醇濃度，這對于預防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病是至關重要的[10-11]。同時乳酸菌還顯示了具有非常強的清除氧自由基的能力，能在食用含有抗氧化作用的食物時，對其致癌作用的各個階段起到預防作用[9]。作者從傳統風干香腸中分離出乳酸菌，對其抗氧化活性等益生特性進行了體外評估，為乳酸菌替代抗氧化劑的應用和進一步研究打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料發酵食品風干香腸：購自大連市場；主要試劑膽固醇、乙酸等：國藥集團化學試劑公司。鄰苯二甲醛（Sigma），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Johnson Matthey）；PCR反應所用的相關試劑：購于大連寶生物。

1.1.2 主要儀器UV-2450分光光度計：日本島津；DNP-9052恒溫培養箱：上海精宏；JY92-IIN超聲破碎儀：寧波新芝；TC-512基因擴增儀：Techne。

1.2 培養基

分離用培養基：MRS培養基（Merck）和M17培養基（Oxoid）。其它培養基：PY培養基、PYG培養基、含6.5、18 g/dL NaCl的MRS培養基[12]和含0.10 mg/mL膽固醇的膠束液體培養基[13-14]。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離及純化取1.0 g樣品加入9.0 mL無菌水室溫浸泡24 h。連續稀釋后涂布于含碳酸鈣的兩種分離固體培養基，37℃靜置培養24～48 h。挑取產生溶鈣圈的單菌落，純化兩次。篩選過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性、發酵產乳酸[15]的菌株進行下一步研究。

1.3.2 菌落形態、菌體細胞形態及生理生化特性乳酸菌接種平板后，37℃培養48 h后，記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色等菌落特征。同時高倍顯微觀察菌體革蘭氏染色、個體形狀、大小等細胞特征。分別測定菌株在10℃和45℃的生長情況、運動性、耐鹽性、葡萄糖發酵產酸產氣試驗等生理生化特征[12]。

1.3.3 菌株的分子生物學鑒定將純化得到的菌種在37℃條件培養2 d后，離心收集菌體；提取細菌總DNA。采用通用引物對其16S rDNA進行擴增，并進行測序后將序列輸入NCBI核酸數據庫中，與基因庫核酸序列進行比對。并利用MEGA5.0軟件中鄰接法（Neighbor-Joining），采用Kimura-2參數模型進行系統發育樹的構建[15]。

1.3.4 乳酸菌的降膽固醇性能測定鄰苯二甲醛法的膽固醇標準曲線測定[16-17]，質量濃度范圍為5～25 μg/mL。乳酸菌液體培養活化后，以5%接種體積分數接種于含膽固醇液體培養基，37℃分別培養24、36、48、60 h。搖勻后取菌懸液離心，取沉淀經冷凍干燥后稱量干重；另取0.5 mL培養液加3 mL的95%乙醇，再加2 mL氫氧化鉀乙醇溶液（12 g/dL）；充分混勻后60℃水浴加熱20 min；迅速冷卻后，加入5 mL正己烷，充分混勻（20 s～1 min），加3 mL無菌超純水；取上清液加正己烷2.5 mL于10 mL具塞試管中，60℃氮吹干，加2 mL冰乙酸溶解，加2 mL顯色劑 （1.0 mg/mL鄰苯二甲醛/冰乙酸溶液）、2 mL濃硫酸迅速充分混勻；放置10 min，550 nm條件下測吸光度值[16-17]。根據標準曲線測定膽固醇濃度，同時測定培養基初始的膽固醇質量濃度。

1.3.5 乳酸菌的體外抗氧化試驗取10 mL培養液，8 000 r/min離心10 min，無菌水洗滌3次，制成菌懸液，血球計數板計數并調整細胞濃度至109CFU/mL[15]。所得菌懸液分為兩組，一組作為完整細胞組；另一組超聲破碎儀280 W，間隔5 s處理5 s，至顯微鏡下檢查沒有完整菌體為止，大約10 min。采用Fenton體系測定乳酸菌對羥自由基 （·OH）的清除活性[15，18]；測定乳酸菌對DPPH自由基的清除活性[15，18]；鄰苯三酚自氧化法測定乳酸菌對超氧陰離子自由基（O2－）的清除活性[15，18-19]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選

共篩選出13株疑似乳酸菌，接觸酶試驗篩選出8株陰性菌株。高效液相色譜法對發酵液的檢測結果表明，8株均產乳酸。選取生長較好的一株ORC4進一步研究。

2.2 菌株的多相鑒定

2.2.1 菌落、細胞形態及生長特性觀察乳酸菌ORC4菌落呈乳白色、低凸面、表面光滑，直徑小于0.3 mm；細胞呈近球形或者短桿狀，革蘭氏染色為陽性，見圖1。兼性厭氧，不運動，不形成芽孢；6.5、18 g/dL NaCl和45℃條件均能生長，而在10℃不能生長，發酵葡萄糖產酸不產氣，見表1。

2.2.2 16S rDNA序列分析以菌株 ORC4總的DNA為模板，獲得了1條長度1 410 bp特異的擴增條帶，序列的GenBank登錄號為KC108670。通過Blast程序與數據庫中序列進行比對，發現ORC4與Weissella viridescens NRIC 1536（T）的相似性為100%。將魏斯氏菌屬現有18個種[20]的模式菌16S rRNA序列，與菌株ORC4進行聚類分析，見圖2。菌株ORC4與W.viridescens NRIC 1536（T）在同一分支上。結合菌株的形態特征、生理生化特征，可以確定菌株ORC4屬于魏斯氏菌屬（Weissella）中的綠色魏斯氏菌（W.viridescens）。

圖1 菌株細胞形態的顯微觀察（×100）Fig.1 Cells morphology of the strain（×100）

表1 菌株的生長特性Table 1 Growth characteristics of the strains

圖2 菌株ORC4和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain ORC4 and the reference strains

2.3乳酸菌的益生特性研究

2.3.1 乳酸菌降膽固醇能力測試室溫條件下，測定膽固醇的標準曲線為：Y=6.539 3X+0.002 7，R2=0.998 5，說明膽固醇質量濃度（X）和吸光值（Y）呈良好的線性關系，可以用該法測定培養基中膽固醇的質量濃度。

乳酸菌ORC4能降低培養基中的膽固醇，見圖3。隨著培養時間的增加，膽固醇降解量和單位細胞干重的降膽固醇量均升高；而在36～48 h之間，膽固醇降解速度和單位細胞干重的降膽固醇速度都有明顯增加的趨勢；但在60 h，菌株ORC4能清除35.87 μg/mL的膽固醇，而單位細胞干重的降膽固醇量與48 h時相比基本不變，為19.87 μg/mg。

圖3 培養時間對乳酸菌降膽固醇的影響Fig.3 Cholesterol-lowering ratio of LAB during growth

2.3.2 乳酸菌對自由基清除活性的測定由圖4可以看出，乳酸菌ORC4的完整細胞和破碎細胞對O2-·、·OH和DPPH·均有清除能力，且清除率與細胞濃度（破碎細胞也以細胞濃度作為單位）呈正相關。當細胞濃度為5×108CFU/mL時，破碎細胞對三個自由基的清除率都大于45%，對DPPH的清除率最高，為56.17%；均高于完整細胞對自由基的清除（完整細胞的清除率均低于40%），完整細胞對·OH的清除率最低，只有14.73%。細胞破碎對·OH的清除率影響最大，達到54.01%。

3 結語

乳酸菌在自然界分布廣泛，作者從發酵香腸中初步分離得到H2O2酶陰性、革蘭氏陽性、發酵液產乳酸的乳酸菌13株，從中篩選到一株生長良好的乳酸菌ORC4。根據菌落、細胞形態、生理生化特性、以及16S RrDNA序列比對，可鑒定ORC4為綠色魏斯氏菌。

圖4 完整細胞和破碎細胞對自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of intact cells and intracellular extract on hydroxyl radical

經過抗氧化測定試驗，發現綠色魏斯氏菌ORC4對自由基O2-·、DPPH·和·OH都有一定的清除能力，其細胞濃度（包括完整細胞和破碎細胞）與自由基的清除率均分別呈正相關。在細胞濃度為5×108CFU/mL時，菌株ORC4破碎細胞對O2-·、DPPH·和·OH的清除率都大于45%；而完整細胞對3種自由基的清除率均低于40%；破碎細胞對·OH的清除率變化最大，完整細胞為14.73%而破碎細胞為54.01%。體外降膽固醇試驗發現綠色魏斯氏菌ORC4具有降解培養基中膽固醇的能力，降解量隨著培養時間的增加、菌體量的增長呈上升趨勢，菌株ORC4在36～48 h對膽固醇的降解量增加明顯；而在48 h后的降解趨勢進入一個平穩期，單位細胞干重的降膽固醇量為19.89 μg/mg；在60 h時，膽固醇降解量是35.87 μg/mL。

當前對心血管疾病的藥物治療，因其相對成本高和相關聯的副作用，不被認為是長期的最佳選擇[9]。乳酸菌能通過改善腸道微生態平衡清除自由基實現延緩衰老[8]。國內外報道的相關乳酸菌種類主要集中在乳桿菌屬，如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等[21-22]。對魏斯氏菌屬的抗氧化、降膽固醇能力的研究很少，本實驗篩選出的一株綠色魏斯氏菌，并對其清除自由基、去除膽固醇的能力進行了研究，這樣就可以充分利用乳酸菌開發出功能性發酵食品、提高發酵食品的附加值。

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Antioxidative and Cholesterol-Rducing Ability of Weissella viridescens ORC4 from Dry Fermented Sausages

LIU Changjian， LIU Qiu*， JIANG Bo， YAN Jianfang， QI Xiaohui
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

A Gram （＋），non-motile，facultatively anaerobic，rod-or coccoid-shaped bacterium，designated strain ORC4，was isolated from the dry fermented sausages.The 16S rRNA gene sequence analysis showed that strain ORC4 belonged to the genus Weissella，with highest sequence similarity to Weissella viridescens NRIC1536（100%）.The intact cells and intracellular extract of strain ORC4 could inhibit O2-·，DPPH·，and·OH.Three free radicals-scavenging ratios of intracellular extract were positively correlated with bacterial density，respectively，the intact cells could do the same.The intracellular extract had higher scavenging ratios on three free radicals than the intact cells.At a concentration of 5×108CFU/mL，scavenging ratios of intracellular extract on O2-·，DPPH·and·OH were 45.17%，56.17%and 54.01%respectively.In addition，strain ORC4 could reduce 35.87 μg/mL cholesterol，and the unit cell dry weight of cholesterol removal rate was 19.89 μg/mg.

dry fermented sausages，Weissella viridescens，16S rDNA，phylogenetic tree，antioxidative effect，cholesterol-reducing ability

TS 201.3

A

1673—1689（2015）05—0512—05

2014-02-11

國家自然科學基金項目（31070005）；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（DC12010103，DC120101034）。

劉長建（1975—），男，遼寧普蘭店人，工學碩士，高級工程師，主要從事應用微生物方面的研究。E-mail：lcj@dlnu.edu.cn

*通信作者：劉 秋（1969—），女，遼寧普蘭店人，農學博士，教授，碩士研究生導師，主要從事放線菌應用方面的研究。

E-mail：liuqiu@dlnu.edu.cn

35.87 μg/mL的膽固醇，單位細胞干重的膽固醇清除率為19.89 μg/mg。