Sphingomonas sp.生產威蘭膠分批發酵動力學

許曉鵬， 鄭志永， 朱 莉， 詹曉北*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糧食發酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

Sphingomonas sp.生產威蘭膠分批發酵動力學

許曉鵬1，2， 鄭志永1， 朱 莉1， 詹曉北*1，2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 糧食發酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122）

為了優化革蘭氏陰性棒狀桿菌（Sphingomonas sp.）生產的發酵過程，對該菌發酵生產威蘭膠分批發酵動力學進行了研究，利用數學建模方法得到了描述該菌株在7 L發酵罐中菌體生長、威蘭膠合成和氮源消耗動力學數學模型。實驗和模型數據的比較結果證明，該模型計算值與實際結果擬合良好，為其應用在威蘭膠的放大工業化生產提供了依據。

威蘭膠；革蘭氏陰性棒狀桿菌；發酵動力學；數學模擬

威蘭膠 （welan gum）是革蘭氏陰性棒狀桿菌（Sphingomonas sp.）發酵生產的一種微生物胞外多糖，威蘭膠的結構骨架由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖單元組成。在葡萄糖及鼠李糖相連的葡萄糖殘基的C3位上連接有α-L-鼠李糖或α-L-甘露糖支鏈[1]，連接鼠李糖的幾率占2/3；此外，約有半數的四糖片段上帶有乙酰基及甘油基團[2-3]。威蘭膠中含有2.8%～7.5%乙酰基，11.6%～14.9%的葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖和鼠李糖的摩爾比例為1∶2∶2[4]，結構式見圖1。

圖1 威蘭膠的結構式Fig.1 Structure of welan gum

威蘭膠具有優良的觸變性、懸浮性、水溶性等流變性能，且具有卓越的穩定性，市場前景廣闊。它主要作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑、潤滑劑、成膜劑和粘合劑應用于工農業的各個方面，尤其在混凝土、石油、石墨等工業中有廣泛的應用前景。

威蘭膠是美國的CP Kelco公司20世紀80年代繼黃原膠、結冷膠之后開發的最具市場前景的微生物代謝多糖之一。目前CP Kelco公司已成為威蘭膠全球惟一的生產和供應商，國內在這方面研究較少[5-8]。作者對Sphingomonas sp.ZJ01進行發酵實驗，采用matlab編程軟件對實驗數據進行擬合，得出數學模擬公式，以便對以后的實驗和生產提供幫助。

研究發酵動力學是實現發酵過程最優控制的前提條件，也是研究發酵過程放大及從分批發酵過渡到流加發酵、連續發酵的理論基礎。動力學模型的建立，離不開模型參數的估算。目前常見數學模型的參數擬合方法有線性轉化法、非線性擬合法和遺傳算法。線性轉化法比較簡單，不需要高深的數學知識，但由于違背了某些統計學規律，往往擬合誤差較大。非線性擬合法能直接擬合，但當動力學方程存在多個局部極值的情況下容易陷入局部最優，擬合值讓人不放心。而遺傳算法具有多點尋優、并行處理等特點，搜索過程是從初始解群開始，以適應函數作為尋優判據，適者生存，劣者淘汰，直接對解群進行操作，不依賴模型的具體表達式，因此，它搜索面廣，尋優效率高，能以較大概率逼近全局最優解。代志凱[9]比較了線性轉化擬合、非線性擬合和遺傳算法擬合法三種方法的擬合效果，結果表明：線性轉化法擬合誤差較大，非線性和遺傳算法擬合效果較好，但遺傳算法能以較大概率逼近全局最優，而非線性擬合法則容易陷入局部最優。因此作者采用遺傳算法對菌體生長動力學進行擬合。

發酵動力學是對微生物生長和產物形成過程的定量描述，它研究微生物生長、發酵產物合成、底物消耗之間的動態定量關系，確定微生物生長速率、發酵產物合成速率、底物消耗速率及其轉化率等發酵動力學參數特征，以及各種理化因子對這些動力學參數的影響，并建立相應的發酵動力學過程的數學模型，從而達到認識發酵過程規律及優化發酵工藝，提高發膠產量和效率的目的。

在微生物發酵過程中，發酵動力學是發酵過程優化和控制的重要基礎，通過發酵動力學的研究，有助于深入了解微生物代謝的規律，從而有利于建立合理的發酵工藝或對已有的發酵過程進行優化[10]。Moser等按建模方式將其分為3類：機制模型、數學模型和正規模型。由于微生物反應過程非常復雜，在發酵過程中建立機制模型幾乎不可能，所以目前國內外學者所建模型大多為第2類和第3類，其中又以數學建模較為簡便，使用得最為廣泛[11]。

微生物分批發酵動力學主要研究微生物在分批發酵過程中生長動力學、基質消耗動力學和代謝產物生成動力學。

威蘭膠發酵碳源為過量的底物，因此其對菌體的生長有底物限制作用，而隨著威蘭膠濃度的增加其對菌體生長亦有限制的作用，因此作者在Monod方程[10]μ=的基礎上，增加了底物抑制和產物抑制對菌體生長的影響，使方程更能反映菌體實際的生長過程。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

Sphingomonas sp.ZJ01：江南大學 生化工程與生物反應器實驗室自行保藏；蔗糖、葡萄糖、酵母粉、大豆蛋白胨、麥芽提取物、魚粉蛋白胨、NaNO3、KH2PO4、NaOH、MgSO4·7H2O：購自中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基種子培養基（g/L）：葡萄糖10，酵母粉3，麥芽提取物3，魚粉蛋白胨5；pH 7.0，115℃滅菌20 min，固體培養基添加質量分數為2%的瓊脂。

發酵培養基（g/L）：蔗糖 40，大豆蛋白胨0.7，NaNO34，KH2PO40.6，MgSO4·7H2O 0.2；121℃滅菌20 min。

1.2.2發酵工藝取兩環經活化的菌種，接種到500 mL的種子瓶中，裝液量為100 mL，30℃恒溫搖床200 r/min培養24 h得到種子液，以接種體積分數6%接種至7 L發酵罐 （Bio flo115發酵罐，美國New Brunswick公司），通氣量1 vvm，轉速與溶氧相關聯，控制溶氧不低于30%，發酵周期70 h，取樣間隔4 h，裝液量4 L，pH值控制在7.0。

1.2.3 發酵液中NaNO3濃度的測定采用酚二磺酸法測定[12-13]。取1 g發酵液加入4 g去離子水。混勻后于10 000 r/min離心20 min，取0.20 mL上清液，加入0.80 mL酚二磺酸溶液混勻后靜置30 min，加2 mol/L NaOH溶液定容至20 mL，410 nm波長測定吸光度。

1.2.4 發酵液中生物量的測定分別稱取發酵液3 g放入100 mL錐形瓶中，加濃鹽酸3.0 mL，室溫下（25℃左右）浸泡24 h，稀釋至HCl濃度為8.5 mol/mL，沸水浴 45 min進一步消化，冷卻后用 1 mol/L NaOH溶液中和至pH 7，移入100 mL容量瓶，定容，過濾。準確量取濾清液1.00 mL，加入1.00 mL蒸餾水，置10 mL具塞比色管中，加1.00 mL乙酰丙酮試劑，搖勻，沸水浴25 min，取出冷水至室溫，再加無水乙醇2.00 mL搖勻，加入對二甲氨基苯甲醛試劑1.00 mL，再以無水乙醇定容至10 mL，搖勻，于80℃水浴2 h，水冷至室溫，以空白溶液（不加試樣，其余步驟相同）為參比，測定525 nm波長處的吸光度。每個試樣平行測定3次，取3次平行測定的平均值[14]。

1.2.5 產膠率的測定定量稱取發酵液，三倍發酵體積的95%酒精沉淀，離心、用少量75%酒精清洗沉淀兩次，80℃烘至恒重，稱干膠質量，干膠質量與發酵液質量的比即為產膠率。

1.2.6 發酵動力學模型本實驗采用的動力學公式為：

式中：μ為微生物細胞生長速率；μm為微生物細胞最大生長速率；Ks是底物親和常數；S為底物濃度；X為微生物細胞濃度；Xm為最大微生物細胞濃度；P為代謝產物濃度；Pm為最大產物濃度；qs為限制性底物消耗速率；Y*x/s為底物轉化為微生物細胞的轉化率；qp為產物生成速率；α、β為常數。

根據產物形成與菌體生長的關系，將產物的形成分為三類：1）產物生產與菌體生長無關；2）產物生產與菌體生長部分偶聯；3）產物生產與菌體生長沒有關系。當α=0，β≠0時產物行成與細胞生長無關；當α≠0，β≠0時產物形成與細胞生長部分偶聯；當α≠0，β=0是產物形成于菌體生長相偶聯。

采用Matlab遺傳算法的程序進行擬合，根據實驗值擬合公式中的各參數的值，為之后的實驗和工業化生產提供幫助。

遺傳算法（Genetic algorithms，GA）是一種基于生物自然選擇與遺傳機理的隨機搜索算法，以其高效、自適應及益于全局搜索的優勢在很多領域中得到應用。它的搜索面廣，尋優速度快，得到的結果能以較大概率接近全局最優解。對于解決分批發酵動力學參數，遺傳算法較傳統的方法具有不可比擬的優勢[15-16]。

2 結果與討論

發酵實驗數據見表1。

表1 發酵過程的參數值Table 1 Value of Sphingomonas sp.ZJ01 fermentation

發酵35 h后菌體濃度緩慢升高，主要是菌體到達穩定期，另外隨著粘度的升高，系統的傳質也受到了影響，因此也限制了菌體的生長。由圖2可以看出，在菌體濃度增長明顯趨緩時，產膠速率并沒有明顯的改變，主要是因為產膠是以一定菌體濃度為基礎的，葡萄糖在細胞內部合成威蘭膠并排出細胞外，隨著粘度的增加，傳質和傳氧都受到影響，產膠率也會達到穩定值。圖2發酵液中殘氮下降速度也逐漸變慢，這和菌濃增長速度的變化相吻合，由圖2（實線為Matlab擬合的曲線，圓圈為實測的值）看出，Matlab擬合的公式很好的反映了威蘭膠發酵的菌濃變化，限制性底物氮源的變化和威蘭膠產物的變化過程。

通過反復擬合得出方程（1）、（2）、（3）三個方程的參數值分別為Ks、Xm、Pm、α、β。

圖2 Sphingomonas sp.ZJ01發酵動力學模型與實驗數據的擬合Fig.2 Simulation of experimental data by kinetic model of Sphingomonas sp.ZJ01

由表2可以看出，Pm，Xm明顯比實際值大的多，說明隨著發酵的進行，體系粘度越來越大，產膠速率和菌體增長速率會受到很大影響，從而在發酵后期產物的反饋抑制占據主導地位，因此菌體濃度和產膠率會比模擬值小很多。

表2 動力模型參數值估算值Table 2 Estimated value of kinetic model parameter

以上得到分批培養的模擬方程的方程組為：

3 結語

作者根據威蘭膠產生菌Sphingomonas sp.ZJ01的發酵特點，分別考慮到底物抑制、產物抑制、生物量抑制等方面對生物比生長速度的抑制，采用遺傳算法模擬出與實際發酵過程曲線擬合度較高的模擬曲線，說明最初選取的擬合公式體現了影響威蘭膠產生菌Sphingomonas sp.ZJ01發酵的主要因素，對后續策略性優化調控威蘭膠的發酵具有一定的指導作用。

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Study on Welan Gum Fermentation Dynamics of Sphingomonas sp.

XU Xiaopeng1，2， ZHENG Zhiyong1， ZHU Li1， ZHAN Xiaobei*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The EPS welan gum batch fermentation dynamics of Sphingomonas sp.were demonstrated.The mathematics models of the dynamic parameters of Sphingomonas sp.growth in 7 L fermentation reactor，synthesis of welan gum，and consumption of nitrogenous source were depicted. The estimated model parameters were confirmed bythe batchfermentation experiment data.These models offered the evidences for large scale production of welan gum.

welan gum，Sphingomonas sp.，fermentation dynamics，math model

TQ 920.1

A

1673—1689（2015）05—0507—05

2014-02-20

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2011BAD23B04）；國家863計劃項目（（2012AA021505）；無錫市科技支撐計劃項目（CLE01N1208）。

許曉鵬（1978—），男，吉林白山人，發酵工程專業博士研究生，工程師，主要從事發酵工程及產物分離提取方面的研究。

E-mail：xuxiaopeng@jiangnan.edu.cn

*通信作者：詹曉北（1962—），男，北京人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業發酵與生物化工、糖生物技術方面的研究。

E-mail：xbzhan@yahoo.com