新型鹵代醇脫鹵酶基因的克隆、序列分析及表達

馮 峰， 胡 蝶， 余 濤， 曾 妍， 鄔敏辰

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

新型鹵代醇脫鹵酶基因的克隆、序列分析及表達

馮 峰1， 胡 蝶2， 余 濤1， 曾 妍1， 鄔敏辰*3

（1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 無錫醫學院，江蘇 無錫214122）

鹵代醇脫鹵酶可以催化合成具有光學純的環氧化物及β-取代醇等高價值手性藥物中間體。作者所在實驗室利用宏基因組技術從無錫新區工業集中地污染土壤中篩選了一段編碼基因Y，經測序知其片段包含有765 bp的核苷酸，編碼254個氨基酸。經Blast軟件分析，其氨基酸序列與來自根癌土壤桿菌 （Agrobacterium tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶HheC同源性為81%，且含有鹵代醇脫鹵酶類的保守催化三聯體Ser132-Thr145-Arg149。推測其屬于鹵代醇脫鹵酶HheC類，命名為SyHheC。根據大腸桿菌Escherichia coli BL21的密碼子偏愛性，對基因Y進行密碼子優化和人工合成，命名為SyhheC，構建重組表達質粒pET28a-SyhheC，轉化感受態E.coli BL21，表達產物經鎳柱親和層析后獲得電泳純的重組鹵代醇脫鹵酶reSyHheC。SDS-PAGE分析，reSyHheC的相對分子質量為34 000。以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，reSyHheC催化底物產生2-（4-硝基苯基）環氧乙烷的比活性為5.2 U/mg。

鹵代醇脫鹵酶；宏基因組技術；序列分析；密碼子優化；表達

鹵 代 醇 脫 鹵 酶 （EC 4.5.1.-，Halohydrin dehalogenase，HHDH）是細菌降解環境中重要污染物有機鹵化物的關鍵酶之一，具有與其它已知脫鹵酶不同的脫鹵機制[1]。通過分子內親核取代機制催化鄰鹵醇轉化為環氧化物和鹵化氫，是微生物降解重要的環境污染物有機鹵化物的關鍵酶之一。同時該酶在催化環氧化物的開環反應中，可高選擇性的催化接受如X-、N3-、NO2-、CN-等親核基團，生成一系列光學純的β-取代醇，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應用前景[2]。

目前，國內外對于產新酶菌株篩選的報道有底物篩選法、基因狩獵法和宏基因組技術等。底物篩選法具有工作量大、盲目性大等缺點；基因狩獵法雖有一定的優勢，但卻不能對那些不可培養的微生物的基因組進行運用，而這些不可培養的微生物卻是新基因及新酶的重要來源；宏基因組技術通過直接從環境中提取全部微生物DNA，為后續的篩選提供更加全面的基因資源，增加了獲得新功能基因的機會[3-4]。如Michael Kotika等[5]利用宏基因組技術從土壤中挖掘出環氧化物水解酶 （epoxide hydrolases），因而是一種快速有效的挖掘新酶的方法。

利用宏基因組技術，作者從無錫新區工業集中區污染土壤中篩選出了一段編碼基因Y，經送上海生工測序得知其序列，并通過同源比對方法分析其氨基酸序列，推測其為一種新型鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）。對該酶的基因序列進行密碼子優化后經人工合成并命名為SyhheC；將優化基因與表達質粒pET28a連接于大腸桿菌 Escherichia coli BL21（DE3）中表達，誘導表達產物經鎳離子親和層析純化，獲得電泳純的重組鹵代醇脫鹵酶reSyHheC，以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，測定reSyHheC的酶活力。本研究為該新型鹵代醇脫鹵酶的深入研究奠定了基礎，同時也為其它新酶基因的開發提供了新的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和培養基

大腸桿菌E.coli JM109、E.coli BL21（DE3）和表達質粒pET28a：Invitrogen公司；質粒pUCm-T：上海Sangon公司；LB培養基：1 g/dL Tryptone、0.5 g/dL Yeast Extract、1 g/dL NaCl（固體培養基添加2 g/dL瓊脂）；富集培養基的配置參照文獻[6]。

1.2 主要試劑和儀器

250 bp DNA Ladder marker、低相對分子質量蛋白質marker、rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、各種限制性內切酶：大連TaKaRa公司；2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇、1，3-二氯-二丙醇 （1，3-DCP）、N，N-二甲基甲酰胺、鹽酸半胱氨酸、K2HPO4和KH2PO4等其它試劑：國產或進口分析純；快速DNA提取檢測試劑盒 （KG203）：天根生化科技 （北京）有限公司；一站式His標記蛋白質微量純化套裝：北京天恩澤基因科技有限公司；戴安UltiMate-3000高效液相色譜儀：戴安 （中國）有限公司：ZW&A-C18反相色譜柱：科奧美萃生物科技公司。

1.3 引物的設計與合成

用于驗證宏基因組中是否含有鹵代醇脫鹵酶基因，其簡并引物GB1，MB1的設計參照湯麗霞[7]等方法。根據已知的來自根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶HheC（序列號：AF397296）[1]，結合生物信息學分析的手段，設計出一對特異性的上下游引物T2-F，T2-R，見表1。

1.4 鹵代醇脫鹵酶基因的克隆

土壤DNA提取參照Knietsch[7]等的方法進行。分別取2 g樣品加入20 mL富集培養基中，30℃、180 r/min培養1 d；1 000 r/min離心10 min，收集上清液，當菌體OD600值為0.2～0.4時，10 000 r/min離心20 min收集菌體；得到的菌體加入20 mL不含酵母提取物的富集培養基中，含有10 mmol/L 1，3-DCP作為惟一碳源，30℃、180 r/min培養4 d，每天檢測菌體濃度；收集菌體，用細菌基因組提取試劑盒（KG203）提取DNA，-20℃保存備用。以提取的細菌DNA為模板，GB1，MB2為引物按如下條件進行第一輪PCR擴增：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環；72℃充分延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠回收、與pUCm-T連接，轉化E.coli JM109，藍白斑篩選陽性轉化子，送上海Sangon公司測序。以提取的細菌DNA為模板，T2-F，T2-R為引物按如下條件進行第二輪PCR擴增：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個循環；72℃充分延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠回收、與pUCm-T連接，轉化E.coli JM109，藍白斑篩選陽性轉化子，送上海Sangon公司測序，將獲得的基因命名為Y。

1.5 基因Y編碼的氨基酸序列分析

利用DNAMAN 6.0軟件將獲得的基因Y翻譯成氨基酸序列。用NCBI中的Blast在線工具和DNAMAN 6.0進行氨基酸序列同源性分析[8]。

1.6 鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）基因的密碼子優化

根據測序結果對基因Y進行密碼子優化和人工合成[9]，同時在目的基因兩端分別加NcoⅠ和NotⅠ限制性酶切位點，在5'端添加組氨酸標簽，并命名為SyhheC。優化后的基因由上海Sangon公司合成并與pUCm-T連接，獲得重組質粒pUCm-TSyhheC。

1.7 鹵代醇脫鹵酶重組表達質粒的構建

分別用限制性內切酶NcoⅠ和NotⅠ雙酶酶切質粒pUCm-T-SyhheC和表達載體pET28a，回收目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶于16℃連接16 h，將連接產物轉化感受態E.coli BL21，接種于含卡那霉素（100 μg/mL）的LB培養板上，于37℃培養過夜，挑取單菌落，接種于液體LB培養基中擴增，利用T7引物進行菌液PCR鑒定，挑選陽性重組子送上海Sangon公司測序。測序正確后命名該重組表達質粒為pET28a-SyhheC。

1.8 鹵代醇脫鹵酶的誘導表達

挑取陽性菌株E.coli BL21/pET28a-SyhheC接種于含卡那霉素的2 mL LB培養基中，37℃、220 r/min培養12 h。取300 μL培養液轉接于30 mL含有100 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，于37℃、220 r/min振蕩培養至OD600為0.6～0.8時，向培養物中添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，于25℃、220 r/min振蕩培養12 h后，在4℃、8 000 r/min離心收集菌體[10]。以pET28a空質粒轉化的E.coli BL21菌株在同樣條件培養作為陰性對照，表達產物用SDS-PAGE進行檢測分析。

1.9 重組鹵代醇脫鹵酶（reSyHheC）的純化

將離心收集的重組菌 E.coli BL21/pET28a-SyhheC懸浮于0.1 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.0）中進行超聲破碎。破碎條件：工作4 s，間隔6 s，工作時間10 min。超聲破碎后16 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。將粗酶液經微孔濾膜 （0.45 μm）過濾后上樣至預先用100 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液 （pH 7.0）平衡的1 mL鎳離子親合層析柱，結合 30 min后用 100 mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.0）配置成200 mmol/L的咪唑液洗脫，獲得目的重組鹵代醇脫鹵酶（reSyHheC），全部純化步驟在4℃下進行。純化reSyHheC經SDS-PAGE檢測，蛋白質濃度測定使用Bradford法，以牛血清蛋白作為標準蛋白質。

1.10 reSyHheC酶活力的測定

采用高效液相色譜法測定reSyHheC酶活力[11]。取100 μL、100 mmol/L的2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇 （DMF配置）于1.5 mL EP管中，再加入800 μL、pH 7.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液。于40℃預熱5 min，加入100 μL適當稀釋的酶液，40℃下反應8 min。吸取200 μL反應液加入800 μL甲醇終止反應，立即混勻進行高效液相色譜 （HPLC）分析。在上述反應條件下，每分鐘產生1 μmol 2-（4-硝基苯基）環氧乙烷所需的酶量定義為1個酶活性單位（U）。

2 結果與討論

2.1 鹵代醇脫鹵酶基因的克隆

以提取的細菌DNA為模板，GB1、MB2為引物進行PCR擴增，經1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約520 bp處有一條明顯的條帶，見圖1（泳道1），這與理論上簡并引物GB1，MB2對來自根癌土壤桿菌（A.tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶 （HheC）基因PCR產物長度相符，割膠回收產物連接至pUCm-T，經過藍白斑篩選和菌液PCR檢測后進行測序。測序獲得512 bp DNA序列，經Blast同源性分析，該序列與根癌土壤桿菌的鹵代醇脫鹵酶 （HheC）基因相似性為70%，表明該基因可能為一種鹵代醇脫鹵酶（HheC）基因。以提取的細菌DNA為模板，以T2-F，T2-R為特異性引物進行PCR擴增，經1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果顯示，在約760 bp處有一條特異性的條帶 （泳道2），PCR產物長度與預期相符，割膠回收產物連接至pUCm-T，經藍白斑篩選和菌液PCR檢測后進行測序。測序結果顯示獲得的Y基因片段含765 bp的核苷酸，包含以簡便引物擴增獲得的序列，該基因共編碼254個氨基酸。

圖1 PCR擴增產物的核酸電泳分析Fig.1 Nucleic acid electrophoresis of PCR amplifications

2.2 基因Y編碼的氨基酸序列分析

利用NCBI數據庫的BLAST軟件，以Y基因的氨基酸序列為模板進行同源性序列比對，結果見圖2。其氨基酸序列與已知的鹵代醇脫鹵酶A.tumefaciens HheC（PDB：1PWX_A）、A.tumefaciens HheB（AAD34609.1）和Arthrobacter sp.AD2 HheA（PDB：1ZMO_A）的相似性分別為 81%、75%和35%。另外，SyHheC還含有保守的鹵代醇脫鹵酶催化三聯體Ser132Thr145-Arg149，故推測SyHheC屬于鹵代醇脫鹵酶HheC類。

圖2 不同鹵代醇脫鹵酶氨基酸的序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of different halogenated alcohol dehalogenation enzymes

2.3鹵代醇脫鹵酶（SyHheC）重組表達質粒的構建

根據大腸桿菌密碼子偏好性，將克隆獲得的Y基因進行密碼子優化，優化后的基因序列SyhheC已提交GenBank數據庫，登錄號為 （KF853591.1），人工合成SyhheC與原Y基因序列對比見圖3。

圖3 人工合成SyhheC序列和篩選Y基因序列對比Fig.3 Compared with designed synthetic gene sequence SyhheC and the screening gene sequence Y

通過密碼子優化后獲得重組質粒pUCm-TSyhheC，經NcoⅠ和NotⅠ雙酶切，與同樣雙酶切的pET28a進行連接，轉化E.coli BL21。經T7通用引物PCR鑒定，可見約1 100 bp的條帶，表明重組表達質粒pET28a-SyhheC成功轉入E.coli BL21。測序結果表明，pET28a-SyhheC中的SyhheC序列與預期相符，見圖4。

2.4 reSyHheC表達及純化

重組菌E.coli BL21/pET28a-SyhheC和陰性菌E.coli BL21/pET28a，經1.0 mmol/L的IPTG于25℃誘導12 h后，SDS-PAGE結果見圖5。與對照E.coli BL21/pET28a相比 （圖5中泳道2），重組菌E.coli BL21/pET28a-SyhheC的表達產物在表觀相對分子質量34 000處有明顯的蛋白質條帶 （圖5中泳道3）。重組菌經超聲破碎、離心獲得粗酶液，粗酶液經鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE結果顯示，蛋白質為單一條帶 （圖5中泳道1）。以底物2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，測得reSyHheC比活性為5 U/mg，而E.coli BL21/pET28a中并未檢測到鹵代醇脫鹵酶活性。結果表明，SyhheC基因在大腸桿菌中實現了高效表達。

圖4 重組表達質粒的鑒定Fig.4 Identification of recombinant expression plasmid

3 結語

近年來，關于鹵代醇脫鹵酶的研究報道逐年增多。傳統的通過基因或cDNA文庫開發新基因的方法工作量較大，而且不易操作[12]。隨著生物信息學技術的發展，挖掘新基因的手段也越來越多[13]。利用生物信息學和基因組學相結合的方法從土壤中挖掘具有優良性狀的新型酶是一條獲取優良酶的有效途徑。

作者成功地利用宏基因組技術從土壤中篩選出一段編碼基因Y，其編碼的氨基酸序列與已知的來自根癌土壤桿菌 （A.tumefaciens）的鹵代醇脫鹵酶（HheC）的同源性為81%。并含有保守的鹵代醇脫鹵酶催化三聯體Ser132-Thr145-Arg149，推測其為一種新型鹵代醇脫鹵酶。根據大腸桿菌密碼子偏好性對Y基因進行密碼子優化并人工合成，與pET28a質粒連接后實現該基因在大腸桿菌E.coli BL21的高效表達。經鎳離子親和層析獲得純化表達蛋白質，通過SDS-PAGE鑒定出reSyHheC的相對分子質量在約34 000。以2-溴-1-（4-硝基苯基）-乙醇為底物，reSyHheC酶催化底物產生2-（4-硝基苯基）環氧乙烷，測定其比酶活為5 U/mg。本研究挖掘了一種新型的HheC基因，為鹵代醇脫鹵酶的深入研究奠定了理論基礎，也為其它新酶基因的開發提供了新的策略。

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Gene Cloning,Sequence Analyais and Gene Expression of A New Halohydrin Dehalogenase

FENG Feng1， HU Die2， YU Tao1， ZENG Yan1， WU Minchen*3
（1.School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Halohydrin dehalogenase catalyzes the synthesis ofoptically pure epoxides，β-substituted alcohol and other similar high-value chiral drug intermediates.Our laboratory screened an encoding gene Y from contaminated soil in Wuxi new district industrial park using metagenomic technology.The gene Y contains 765 bp nucleotides and encodes 254 amino acids. According to the Blast analysis，the amino acids sequence shares 81%homology with HheC from Agrobacterium tumefaciens and also has Ser132-Thr145-Arg149catalytic triad which is the same with the known Halohydrin dehalogenases.Thus，we speculated it belongs to HheC.According to Escherichiacoli BL21 codon preference，the optimized gene was synthesized and named as SyhheC.The constructed expression plasmid pET28a-SyhheC was transformed into E.coli BL21.The expressed enzyme with an apparent molecular weight of 34 000 by SDS-PAGE analysis was purified to homogeneity using Ni-NTA affinity chromatography and characterized using the substrate of 2-bromo-1-（4-nitrophenyl）ethanol.The activity of purified reSyHheC was 5.2 U/mg.This study provides a new strategy to excavate new enzymes with excellent characters from the soil.

halohydrin dehalogenase，metagenomic technology，sequence analysis，codon optimization，expression

Q 785

A

1673—1689（2015）05—0494—07

2014-02-24

國家自然科學基金項目（31271811）。

*通信作者：鄔敏辰 （1962—），男，江蘇無錫人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶工程與基因工程研究。

E-mail：biowmc@126.com