枯草芽孢桿菌產過氧化氫酶的優化與工業化

曹汶龍， 郭婭瓊， 康 振， 堵國成*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

枯草芽孢桿菌產過氧化氫酶的優化與工業化

曹汶龍1，2， 郭婭瓊1，2， 康 振1，2， 堵國成1，2*

（1.江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

為了實現過氧化氫酶的工業化生產，作者對實驗室前期構造成功的B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA）進行了3 L發酵罐的發酵驗證，并且通過數據分析優化了碳氮源濃度，使得過氧化氫酶酶活達到35 398 U/mL，比優化前提高53.41%。在此基礎上，分別進行了24 L發酵罐和500 L發酵罐的放大實驗，最高酶活分別達到28 940、23 190 U/mL。結果表明，該過氧化氫酶在產酶水平上已經達到工業化生產需求，為更大規模的工業化生產奠定堅實的基礎。

枯草芽孢桿菌；過氧化氫酶；優化；放大實驗

過氧化氫酶（Hydrogen peroxide oxidoreductase，編號EC 1.11.1.6.）又稱觸媒（Catalase），簡稱CAT，是廣泛存在于動植物以及微生物體內的一類末端氧化酶。生物在演化過程中逐步建立起的防御系統中，CAT就是關鍵酶之一[1]。CAT的生物學功能是促使過氧化氫（H2O2）分解為分子氧和水，從而防止機體的過氧化，使細胞免于H2O2的毒害[2]。

過氧化氫酶是一種催化效率非常高的生化酶，在臨床、醫藥、紡織等行業具有廣泛的用途。在臨床分析中，CAT對研究腫瘤發病機理、自由基代謝失衡和抗衰老以及鑒別診斷某些疾病具有重要意義[3]。在醫藥行業，由于H2O2具有殺菌、清潔、漂白及消毒的功效，常被用于器械消毒，如在隱形眼鏡消毒過程中添加CAT可分解消毒液中殘留的H2O2；在紡織工業中，傳統的工藝消耗大、污染大[4-5]，利用CAT能快速除去H2O2，可以省去清洗步驟或只需一次冷水洗滌即可。這樣既節約能源、保護環境，又保證了紡織物的質量。

盡管過氧化氫酶具有高效、環保、處理效果顯著等優點，但是其高昂的價格、在工業應用中容易失活等問題依舊阻礙著其在紡織工業中的大規模應用。為了更好地在工業中應用，一方面需要提高發酵水平以降低成本，另一方面考慮到紡織加工處理的工藝條件，需要開發出更加適應高溫和堿性條件的過氧化氫酶用于過氧化氫漂白的后處理[6]。

為了克服上述的困難，在之前的研究中，江南大學生物系統與生物加工工程實驗室篩選出一株耐熱、耐堿CAT的高產菌株B.subtilis WSHDZ-01[7]，利用基因重組技術成功克隆了B.subtilis WSHDZ-01菌株的 CAT基因序列，并將其在 B.subtilis WSHDZ-01中過量表達，最終獲得了一株高產CAT的枯草芽孢桿菌工程菌。

在本研究中，為了提高CAT的產量，并且將其進行工業化生產，我們在實驗室搖瓶發酵研究的基礎上，考察影響CAT產量的關鍵因素，對發酵過程以及培養基碳氮源濃度進行進一步優化，逐級進行放大生產實驗，利用實驗室3 L發酵罐 （型號BioFlo/CelliGen 115，美國NBS公司生產）進行發酵，摸索最優化條件，并在宜興協聯化學有限公司進行24 L和500 L發酵放大實驗，使CAT產量最終達到工業化生產的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質?？莶菅挎邨U菌WSHDZ-01：產過氧化氫酶菌株，由作者所在實驗室篩選得到，作為代謝工程改造菌及發酵宿主。穿梭質粒pstop1622[8]：由德國布倫瑞克大學構建并饋贈，用于重組質粒的構建以及過氧化氫酶基因的表達。

1.1.2 培養基

1）斜面培養基：6°P麥芽汁，瓊脂1.5～2.0 g/dL，pH 7.5。

2）種子培養基：6°P麥芽汁，pH 7.5。

3）基本發酵培養基（g/L）：葡萄糖 10，NaNO35，MgSO4·7H2O 0.5，Na2HPO49.52，KH2PO40.6，FeSO4· 7H2O 0.002 5；pH自然。

根據需要在培養基中添加四環素至終質量濃度為10 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 培養方法B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA）經搖瓶種子培養基 （25 mL/250 mL）于37℃、200 r/min活化，12 h后以5%的接種體積分數轉接到搖瓶基本發酵培養基中 （25 mL/250 mL），37℃、200 r/min培養56 h（OD600nm=1.0時加入0.5 g/dL木糖進行誘導），測定CAT活性。

3 L發酵罐培養：重組菌按照上述方法培養，菌液轉入（5%接種體積分數）發酵罐（3 L罐裝液1.8 L）。通氣量為1.0 vvm，攪拌轉速400 r/min，37℃培養（OD600nm=1.0時加入0.5 g/dL木糖進行誘導），pH不作控制。

24 L發酵罐（宜興協聯生物化學有限公司自行設計）培養：重組菌按照上述方法培養，菌液轉入（1%接種體積分數）24 L發酵罐中發酵 （裝液量60%）。空氣通入量為1.0 vvm，攪拌轉速400 r/min，37℃培養 （溶氧反彈時加入0.5 g/dL木糖進行誘導），pH不作控制。

500 L發酵罐 （宜興協聯生物化學有限公司自行設計）培養：重組菌按照上述方法培養，菌液轉入（1%接種體積分數）24 L發酵罐中（60%裝液量），37℃發酵培養12 h，空氣通入量為1.0 vvm，攪拌轉速150 r/min，12 h后將全部種子液轉入500 L發酵罐中，空氣通入量為1.0 vvm，攪拌轉速150 r/min，37℃培養 （溶氧反彈時加入0.5 g/dL木糖進行誘導），pH不作控制。

1.2.2 CAT檢測方法取一定量發酵液，4℃下12 000 r/min離心10 min，獲得的上清液作為胞外CAT的測定用樣品。

37℃條件下采用分光光度法測定CAT活性，反應體系為3 mL。將0.1 mL待測酶液樣品快速加入到 2.9 mL含 10 mmol/L H2O2的 50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液（pH 7.0）中，用UV-2450型紫外-可見光分光光度計于240 nm處測定H2O2的分解速率。酶活定義為：37℃下每分鐘分解1 μmol H2O2所需酶量為一個酶活單位。

1.2.3 理化參數檢測方法適當加水稀釋發酵液，通過比濁法[9]測定其吸光度值OD600nm，從而確定菌體濃度。

還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法[10]。

硝酸鹽含量測定采用紫外分光光度法[11]。首先將樣品在25 mL具塞比色皿中適當稀釋，然后加入0.5 mL濃度為0.1 mol/L鹽酸，分別測定275 nm和220 nm處的吸光度值。A=A220nm-A275nm，求得吸光度的校準值后，從校準曲線中查得相應的硝酸鹽濃度，響應數值乘以稀釋倍數即得所測樣品的硝酸鹽含量。

2 結果與分析

2.1 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L發酵罐發酵驗證

為了實現直接將工程菌放大至工業化生產，研究 采 用 B.subtilis WSHDZ-01 （pSTOP1622-katA1672）作為出發菌株，進行發酵罐培養條件其產酶情況進行驗證。采用基本發酵培養基組分，裝液量60%，通氣量1.0 vvm，轉速400 r/min，37℃下發酵56 h（溶氧反彈時加入0.5 g/dL木糖進行誘導），間隔4 h取樣測定CAT活性。胞外CAT最高活性出現在48 h，可達23 074 U/mL。通過分析發酵過程中菌體濃度、CAT活力、殘糖等參數之間的關系見圖1。發酵進行12 h后培養基中葡萄糖基本耗完，菌濃無法上升，從而限制了CAT活性的進一步提高。提高菌體濃度可能會對提高酶活有一定的影響，因此設想提高初始碳氮源質量濃度可提高CAT的產量。

2.2 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L發酵罐碳源質量濃度控制

3 L發酵罐發酵驗證得到的數據變化見圖2。菌體在生長過程中快速消耗了大量的葡萄糖，發酵進行12 h后，培養基中葡萄糖基本耗完，葡萄糖質量濃度過低限制了菌體的生長以及氮源的利用。

因此，可以通過增加初始培養基中碳氮源的質量濃度，讓菌體在初始階段大量增殖，而菌體在后期葡萄糖貧乏的條件下更好地利用氮源產生CAT。因此我們采取的策略是維持其他組分及含量不變，使培養基中碳氮源加倍，3 L發酵罐相同發酵條件下培養56 h，測定CAT的產生情況。結果顯示，培養基中碳氮源加倍后胞外CAT的活性大幅上升，48 h時達35，398 U/mL，與單倍碳氮源發酵相比提高53.41%。

圖1 B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）3 L罐發酵參數分析Fig.1 Analysis of B.subtilis WSHDZ-01 （pSTOP1622-katA1672）in a 3 L stirred tank reactor

圖2 3 L罐碳氮源加倍發酵參數分析Fig.2 Extracellular CAT activity of B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）in a 3 L stirred tank reactor with doubled carbon-nitrogen source

2.3 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）24 L發酵罐發酵驗證

在實驗室水平下，B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）在3 L發酵罐的酶活高達35 398 U/mL，已經具備了工業化生產的潛力。因此，我們在宜興協聯化學有限公司進行了逐級放大實驗。首先在24 L發酵罐中對B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）進行發酵。發酵結果見圖3。在雙倍碳氮源條件下，24 L發酵罐中酶活達到28 940 U/mL，而且通過OD600的數值可以發現，在24 L發酵罐中菌體生長狀況不是很好，最高菌濃僅為3 L發酵罐的62.7%，原因可能是在24 L發酵罐中所使用的化學試劑均為工業級，相比實驗室分析純的試劑在純度上有一定的差距，才導致菌體生長狀況不是很好。雖然菌濃不高，但是菌體產酶效率很高，最高酶活為3 L發酵罐的81.7%。已基本滿足工業化的生產需求。

圖3 B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）24 L罐發酵參數分析Fig.3 Analysis of B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）in 24 L stirred tank reactor

2.4 B.subtilisWSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）500 L發酵罐發酵驗證

在24 L發酵罐實驗取得成功后，我們繼續嘗試在500 L發酵罐中進行發酵驗證實驗，結果見圖4?？梢钥闯觯?00 L發酵罐中，菌體的延遲期增長，對數生長期縮短，最后導致菌體生長到最高菌濃所需時間有了一定的延后，從而致使酶活最高點出現在52 h處，達到23 190 U/mL，是24 L發酵罐最高酶活的80.1%。從上述規律可以看出，隨著罐體體積的增加，酶活產量有一定的下降趨勢，發酵周期有所延長，但酶活產量水平已經達到了工業化的生產要求。

3 結語

近年來，隨著過氧化氫酶在紡織、造紙、制漿等行業的普遍應用，市場對過氧化氫酶的需求也呈大幅增長趨勢。尤其是在棉織物的前處理工藝中，過氧化氫酶起著重要的作用，紡織熱漂步驟中使用過氧化氫酶是實現紡織工業節能減排和可持續發展的有效方法。目前商品化過氧化氫酶的價格較高，溫度和pH耐受范圍較低，這些都制約著過氧化氫酶在紡織工業的大規模應用。

作者驗證了B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA1672）在3 L發酵罐中有著優良的產酶能力，并且通過優化碳氮源濃度使得酶活有了大幅度的提升。作者還在24 L發酵罐和500 L發酵罐中進行了放大實驗，發現該菌株在工業化條件下產酶性能依然優良，為工業化大規模生產奠定了堅實的基礎。雖然本研究在產量方面達到了工業化的生產要求，但是仍有一些不足，比如從3 L發酵罐擴大到500 L發酵罐，酶活呈下降的趨勢，其工業化生產的發酵工藝仍有待進一步的研究優化，除此之外，今后的研究還可以圍繞提高過氧化氫酶的耐熱性以及耐堿性展開，以提高其在工業中的應用性能。

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Optimization and Industrial Production of Catalase in Bacillus subtilis

CAO Wenlong1，2， GUO Yaqiong1，2， KANG Zhen1，2， DU Guocheng1，2*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Microorganism catalase，which is an important industrial enzyme，plays an important role in textile industry.To realize the industrial production of catalase，the fermentation on B.subtilis WSHDZ-01（pSTOP1622-katA），which was constructed before，was conducted in 3 L fermentor. Furthermore，the enzyme activity reached 35 398 U/mL after optimization of carbon and nitrogen concentration，which was increased by 53.41%compared with that before optimization.Based on this result，the fermentations in 24 L and 500 L fermentor were carried out，respectively and the maximum enzyme activity was 28 940 U/mL and 23 190 U/mL respectively.The result showed the yield of catalase has met the requirement of industrial production，which lay a solid foundation for larger-scale industrial production.

Bacillus subtilis，catalase，fermentation，optimization，larger-scale production

S 665.2

A

1673—1689（2015）05—0482—05

2014-02-28

國家863計劃項目（2012AA022202）；國家博士后基金面上項目（2013 M540414）；江蘇省博士后基金項目（1301010B）。

*通信作者：堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事發酵過程優化與控制、酶工程與技術、代謝工程技術方面的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn