人體腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的體外代謝轉化

桑尚源， 光翠娥， 江 波

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

人體腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的體外代謝轉化

桑尚源， 光翠娥*， 江 波

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122）

為考察人體腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的體外代謝轉化作用，在牛腦牛心培養液（BHI）和磷酸鹽緩沖液（PBS）兩種離體模型下，研究了大豆皂苷Ⅱ在48 h內被腸道菌群代謝轉化過程，并用HPLC/MS系統對其轉化產物進行分析鑒定。結果顯示，大豆皂苷Ⅱ先被菌群酶轉化為大豆皂苷Ⅳ，在48 h被最終轉化為大豆皂苷元B，表明大豆皂苷在腸道微生物作用下，其糖基被逐步水解生成相對分子質量更小、疏水性更強的代謝物。

大豆皂苷Ⅱ；大豆皂苷元B；腸道菌群；高效液相；質譜

大豆皂苷是主要存在于豆科植物中的一類三萜烯葡萄糖苷，在大豆和豆制品中約為0.5～114 μmol/g[1]。根據其苷元及其連接的糖鏈結構特征，大豆皂苷分為A組、B組、E組和DDMP組。大豆皂苷具有降血脂[2]、降血壓[3]、抗病毒、保肝、抗腫瘤、抗炎抗過敏等藥理作用[4]，有巨大的開發前景。這些大豆皂苷的藥理活性功能可能是經腸道菌代謝后所得的活性代謝產物進入血液發揮其療效[5]。Hu和Chang兩人均已報道，在離體實驗下大豆皂苷Ⅰ會被腸道微生物脫糖降解，代謝產物為大豆皂苷Ⅲ和大豆皂苷元B[6-7]。2010年，Chang等人報道了人腸道菌群在離體實驗下對大豆皂苷Ab的代謝途徑[8]。

作為一種具有代表性的皂苷，大豆皂苷Ⅱ是豆制品中皂苷的主要存在形式之一[1]，其與大豆皂苷Ⅰ同屬B組，見圖1[3]。大豆皂苷Ⅱ具有多種生物活性，如抑制人體腎素活性[3]、抗皰疹病毒（HSV-1）[9]和作為免疫佐劑[10]。為探究大豆皂苷在體內的生物利用度和轉化代謝產物以及代謝產物和生理活性之間的聯系，作者研究了在體外模型中，人腸道菌群是否對大豆皂苷Ⅱ進行相似脫糖降解的代謝轉化作用，并且使用HPLC/MS系統對代謝轉化產物進行初步的分析鑒定。

圖1 大豆皂苷Ⅰ、Ⅱ和大豆皂苷元B的化學結構Fig.1 Structures of soyasaponinsⅠandⅡand soyasapogenol B

1.1 材料與儀器

大豆皂苷Ⅱ標準品 （AS，純度 91.7%）：ChromaDex公司；碳酸鈉、乙醇、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲酸：色譜純，Merck公司；BHI培養基（組分g/L）：牛腦浸粉12.5，牛心浸粉5，葡萄糖2，蛋白胨10，氯化鈉5，十二水合磷酸氫二鈉6.3，碳酸鈉4，半胱氨酸0.25；刃天青（0.1%）1 mL，pH 7.4，115℃滅菌30 min[11]。

5804R型號離心機：eppendorf公司；DG250厭氧工作站：英國Don Whiteley Science（DWS）公司；YM75壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；WATERS ACQUITY UPLC、WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS、Masslynx 4.1工作站：美國Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 在BHI模擬系統中人腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的降解代謝作用取青年健康志愿者新鮮糞便10 g，用100 mL滅菌后的BHI培養液稀釋，（500 g離心10 min），得上層液體繼續離心（10 000 g離心15 min）得菌體，重懸，離心（10 000 g離心15 min）得到菌體，加入10 mL BHI培養液（滅菌后加入質量濃度為1.5 mg/mL的大豆皂苷Ⅱ），密閉恒溫37℃厭氧培養[7]，分別于0、12、24、48 h取樣2 mL，-20℃冷凍待測。

1.2.2 在PBS模擬系統中人腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的降解催化作用菌體的獲得過程同1.2.1，所得菌體加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，滅菌后加入大豆皂苷Ⅱ，質量濃度1 mg/mL）[12]，密閉恒溫37℃轉化反應，分別于0、4、8、12、24、48 h取樣1 mL，-20℃冷凍待測。

1.2.3 代謝轉化產物的分析與鑒定樣品解凍，離心，取上清液加入三倍體積75%乙醇沉淀蛋白質，再次離心后過微孔濾膜，進行HPLC/MS系統檢測。色譜條件：流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸，梯度洗脫；流速為0.3 mL/min；柱溫45℃；色譜柱BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；進樣量2 μL。質譜條件：離子方式ESI+；毛細管電壓3.5 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100℃；脫溶劑溫度400℃，流速為500 L/h；碰撞能量6 eV；質荷比（m/z）范圍50～1 500；檢測器電壓1 800 V。數據的采集和評估使用MassLynx 4.1工作站。

2 結果與討論

2.1 人腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ的代謝轉化結果

一般情況下，大豆皂苷在體內的生物利用度較低，人體吸收少，在腸道內滯留時間長，被腸道微生物中的糖苷酶降解，其含量逐漸降低。本實驗在BHI和PBS兩種體外模擬系統下采用HPLC/MS系統分別對大豆皂苷Ⅱ進行初步定量測定，結果見圖2。

圖2 在兩種發酵系統中腸道微生物對大豆皂苷Ⅱ的體外代謝對照Fig.2 Comparison of in vitro metabolism of soyasaponinⅡin two fermentation systems

由圖2可看出，在左邊BHI系統中，12 h后大豆皂苷Ⅱ大部分被降解，這與Hu等人對大豆皂苷Ⅰ被腸道代謝的研究結果相類似[6]。再由圖2右邊PBS系統得出，大豆皂苷Ⅱ在12 h后全部被降解，說明腸道微生物降解皂苷的糖苷酶類在PBS系統中酶活力更高，這也許是因為在BHI培養液中，微生物需要消耗其它碳源、氮源等物質進行各種其它代謝活動，減少了對大豆皂苷Ⅱ的代謝活力。

2.2 在PBS模擬系統中人腸道微生物對大豆皂苷Ⅱ轉化產物的分析與鑒定

在BHI培養液系統中，由于發酵后培養液成分復雜，較難分析鑒定出大豆皂苷的代謝產物，所以只在磷酸鹽溶液中分析其轉化產物。Zhang等人研究了在磷酸鹽溶液（PBS）中多種大豆皂苷被一種腸道益生菌Lactobacillus rhamnosus轉化降解[12]，并產生一種小分子的物質。在PBS系統中腸道微生物對大豆皂苷Ⅱ的轉化結果見圖3-4。

由圖3可以看出，標準品大豆皂苷Ⅱ在色譜s中保留時間值（RT）為7.38 min，則0 h時樣品色譜p中RT=7.41 min的色譜鋒即確定為大豆皂苷Ⅱ。根據文獻[7-8]報道，大豆皂苷轉化產物的色譜峰RT值一般比初始物大，可確定色譜a中RT=7.51 min色譜峰為轉化產物M1，色譜b中RT=9.75 min色譜峰為轉化產物M2。另根據圖4中色譜p、a和b的質譜圖并參考文獻[13]進一步分析鑒定出，轉化產物M1為大豆皂苷Ⅱ糖鏈末端脫去一個鼠李糖（Rha）生成的大豆皂苷Ⅳ，M2為大豆皂苷Ⅱ脫去整個糖鏈生成的大豆皂苷元B。大豆皂苷Ⅱ及其轉化產物大豆皂苷Ⅳ、大豆皂苷元B的保留時間（RT）值和質譜碎片離子模式數據見表1。

圖3 在PBS系統下人腸道菌群對大豆皂苷Ⅱ轉化產物的LC/MS離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograms of soyasaponinⅡ（s，p）and its metabolites（a，b）by human intestinal microflora in the PBS system

圖4 色譜p、a和b中各主要色譜峰（RT=7.41、7.51、9.75 min）對應的ESI+質譜圖Fig.4 Positive mode mass spectra of soyasaponin II（p，RT=7.41 min），soyasaponin III（a，RT=7.51 min）and soyasapogenol B（b，RT=9.75 min）

表1 大豆皂苷Ⅱ、Ⅳ和大豆皂苷元B的HPLC和MS數據Table 1 HPLC and Mass Spectral Data of SoyasaponinⅡandⅣand Soyasapogenol B

2.3 大豆皂苷Ⅱ在體外PBS模型中代謝動力學模式

人腸道菌群中有許多水解苷鍵的代謝酶，主要有β-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、硝基還原酶等[14]，不同的糖苷酶活力造成代謝積累的皂苷代謝產物不同，進一步會表現出不同的代謝動力曲線。利用HPLC/MS儀器檢測不同代謝時間下的樣品，使用MassLynx 4.1工作站收集和評估數據得出大豆皂苷Ⅱ的代謝動力學機制，結果見圖5。

圖5 大豆皂苷Ⅱ在PBS系統中的體外代謝動力學Fig.5 In vitro dynamic metabolism of soyasaponinⅡin PBS fermentation system

由圖5看出，4 h時大豆皂苷Ⅱ的含量已明顯降低，8 h后幾乎完全被微生物酶水解；轉化產物大豆皂苷Ⅳ含量在4 h時是最高的，隨后逐漸降低，24 h后幾乎完全消失；另一種轉化產物大豆皂苷元B含量逐步增加，在48 h時達到最大。說明大豆皂苷Ⅱ在此體外模型下被腸道微生物酶轉化時，先脫去一個鼠李糖基生成大豆皂苷Ⅳ，再接著脫去阿拉伯糖與葡萄糖酸組成的雙糖鏈，最終生成大豆皂苷元B。這與大豆皂苷Ⅰ具有類似的代謝模式，兩者最終會被降解為大豆皂苷元B[7]，但A組皂苷中大豆皂苷Ab的降解模式除了產生大豆皂苷元A還會積累帶有一分子葡萄糖酸糖鏈的大豆皂苷元 A[8]，說明A組和B組大豆皂苷在腸道中的代謝模式有所不同。

3 結語

大豆皂苷Ⅱ在BHI和PBS兩種模擬系統下均會被人腸道微生物降解，而在PBS中會12 h后會完全降解。在0～4 h內大豆皂苷Ⅱ在PBS中被腸內菌群酶水解為大豆皂苷Ⅳ，48 h后代謝轉化為大豆皂苷元B。基于這些發現，推測來自膳食或藥物的大豆皂苷Ⅱ在人體腸道內會被降解以大豆皂苷Ⅳ和大豆皂苷元B的形式吸收，所以在研究大豆皂苷Ⅱ藥理活性的同時，有必要展開對大豆皂苷Ⅳ和大豆皂苷元B的研究。

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In vitro Metabolism of Soyasaponin II by Human Intestinal Microflora

SANG Shangyuan， GUANG Cuie*， JIANG Bo
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To investigate the metabolism of soyasaponin II by human intestinal microorganisms，the in vitro metabolic transformation of soyasaponin II by intestinal flora in the Brain Heart Infusion（BHI）broth and Phosphate Buffered Saline （PBS）systems was studied for 48 hours，and its metabolites were analyzed and identified by HPLC/MS.The results showed that soyasaponin II was firstly metabolized into soyasaponin IV by intestinal flora and was eventually translated into soyasapogenol B at 48 hours.The above results suggested that soyasaponins lost their sugar moieties due to hydrolysis and yielded smaller and more hydrophobic metabolites by human gut microorganisms.

soyasaponin II，soyasapogenol B，intestinal microflora，HPLC，MS

R 285.5

A

1673—1689（2015）05—0470—05

2014-03-07

國家自然科學基金項目（31201289）；食品科學與技術國家重點實驗室自主探索課題（SKLF-ZZB-201208）。

*通信作者：光翠娥（1976—），女，湖北仙桃人，工學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事食品營養與功能因子方面的研究。

E-mail：guang1226@hotmail.com