白酒釀造谷物類原料中結合態香氣物質的分離及檢測分析

朱偉岸， 吳 群， 李記明， 徐 巖*

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

白酒釀造谷物類原料中結合態香氣物質的分離及檢測分析

朱偉岸1，2， 吳 群1，2， 李記明2， 徐 巖*1，2

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

為更好的了解釀造原料的香氣物質，作者對以非揮發性前體形式存在的結合態香氣物質進行了分析。通過萃取、旋蒸、固相萃取（SPE）得到香氣物質前體，水解后結合態香氣物質從前體釋放，結合頂空固相微萃取（HS-SPME）與氣象色譜-質譜（GC-MS）進行香氣成分分析。作者對高粱、玉米、大麥、小麥、糯米、大米等6種釀造原料進行了分析，共檢測到35種結合態香氣物質，其中醇類4種，酯類3種，醛酮類10種，酸類6種，芳香族類4種，萜類6種，雜環類2種。

釀造原料；結合態香氣物質；固相萃取（SPE）；頂空固相微萃取（HS-SPME）；氣相色譜-質譜（GC-MS）

原料是白酒釀造的基礎，它不僅為微生物提供了賴以生長的能量和營養物質，而且自身含有大量香氣前體物質，對釀造產品的風味產生重要影響。因此，釀造原料的品質會對釀造產品的質量有很大的貢獻。

在國外的葡萄酒研究中，對原料葡萄的研究非常透徹，研究重點主要集中在葡萄自身香氣物質上[1]。品種[2]、生長條件[3]、成熟度[4-5]的不同，都會造成葡萄自身香氣的差異，并影響到葡萄酒的質量。葡萄酒的香氣可分為品種香、發酵香、陳釀香[6]，品種香即葡萄自身香氣，分為游離態和結合態兩種形式，只有游離態的香氣物質才具有香氣效果，結合態香氣物質以前體形式存在，需要釋放變為游離態才是有效的香氣物質[2]，果汁經過固相萃取（SPE）分離得到前體，酶解或酸解后釋放出香氣，進而進行檢測分析[2，7]。而結合態香氣物質可達游離態香氣物質的2～8倍[8]，因此對結合態香氣物質進行研究更有意義。

以谷物類為釀酒原料的白酒，原料的研究主要集中在其自身理化性質上：直連和支鏈淀粉的比例[9]、蛋白質的含量[10]或者單寧[11]、花青素[12]等微量活性物質會影響到微生物的生長，從而影響酒的品質。但是，對原料自身香氣物質的研究卻很少。谷物類原料是固態基質，不能像葡萄汁那樣直接進行固相萃取，從而分離出結合態香氣物質的前體，方法的限制使得谷物類釀造原料中結合態香氣物質的研究不能順利進行。作者研究了原料中結合態香氣物質（前體）的提取方法，并對水解條件進行了優化，以常見的釀酒原料為研究對象，通過頂空固相微萃取與氣象-質譜聯用技術，對結合態香氣物質進行了定性定量分析。該研究不僅完善了原料香氣物質的分析技術體系，而且可以成為評價原料的一種新手段，對釀造產品的品質控制也有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀造原料：江蘇某酒廠；無水乙醇、無水甲醇、無水乙醚、戊烷、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉：分析純，購自上海國藥集團；4-甲基-2-戊醇、乙醇、甲醇及鑒定中標明有RI的化合物：色譜純，購自Sigma-Aldrich（上海）公司；XAD-2樹脂：購自上海安譜科學儀器有限公司。

Agilent GC 6890 N氣象色譜和 5975 MSD質譜儀：美國安捷倫公司；MPS-2自動進樣器：德國Gerstel公司；FFAP色譜柱 （60 m×0.25 mm×0.25 μm）：上海安譜科學儀器有限公司；真空固相萃取裝置（Visiprep DL SPE）：Sigma-Aldrich（上海）公司；循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；BUCHI R-210旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；Milli-Q超純水系統：美國Millipore公司；超聲波處理儀：天津Autoscience公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 前體的萃取參考Cai等[13]關于煙葉中結合態香氣物質提取方法并進行改進，分別用甲醇和乙醇進行先后萃取，并配合超聲處理。將萃取液在30℃下旋轉蒸發至干，加入20 mL超純水將干物質溶解，即得到前體溶液Ⅰ。

1.2.2 前體的分離純化將前體溶液Ⅰ用5 mL重蒸乙醚/戊烷萃取（1∶1）萃取，以除去游離態的香氣物質。參照果汁中結合態香氣物質的分離方法，采用固相萃取（SPE）的方法[2]將得到的前體溶液進一步分離純化，得到更加純凈的前體溶液Ⅱ。

1.2.3 前體水解條件的優化

1）水解pH的優化：前體會在酸性條件下釋放出香氣物質，以高粱樣品作為樣本，用1 mol/L的鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液調節前體溶液的pH，得到pH為6、5、4、3、2、1的樣品溶液。將調好pH的樣品密封后，沸水浴處理30 min。

2）水解時間的優化：按照上述優化后的結果調節前體溶液pH密封后，沸水浴分別處理10、20、30、40、50、60 min。

1.2.4 HS-SPME-GC-MS定性定量分析

1）HS-SPME及GC-MS分析條件：參考Xu等[14]利用HS-SPME-GC-MS測定香氣物質的方法，取8 mL水解后的樣品加入到頂空瓶中，用氯化鈉飽和，加入10 μL內標 （4-甲基-2-戊醇，43.60 mg/L），進行頂空固相微萃取。萃取條件為：60℃平衡5 min，吸附萃取45 min；GC-MS解吸附5 min，250℃。

GC條件：進樣口溫度250℃，載氣 He，流速 2 mL/min，不分流進樣。升溫程序：50℃保持2 min，以6℃/min速率升溫至230℃，并保持15 min。MS條件：EI電離源，離子源溫度 230℃，電子能量 70 eV，掃描范圍35～350 amu。

2）定性及定量分析：首先通過質譜譜庫檢索與NIST 05 a.L庫的標準質譜圖比對定性，然后再通過計算所測物質的保留指數（RI），并與文獻中報道的RI值進行比對定性。以超純水為溶劑配置一定濃度的待測物標準液，并進行梯度稀釋。每個梯度的標準液取8 mL于頂空瓶中進行分析，分析條件與樣品分析條件相同。采用選擇離子（SIM）計算各化合物的峰面積，以化合物和內標物質的峰面積比為橫坐標，質量濃度比為縱坐標，建立標準曲線。樣品經GC-MS檢測后，將待測物質與內標物質的峰面積比代入標準曲線方程，計算出樣品中該物質的質量分數，再換算為原料中的質量濃度。

2 結果與討論

2.1 水解條件的優化

結合態香氣物質的前體需要經過酶解或者酸解才可以變為揮發性的香氣物質釋放出來，酸解與酶解相比所得香氣物質的種類和產量更多。為更好地了解釀造原料中結合態香氣成分，作者選擇了對前體進行酸解處理的方案。但是水解時的pH以及水解時間都會對釋放的香氣含量有影響，因此在進行香氣物質分析之前，對水解條件進行優化，優化的指標為水解后檢測到的香氣物質總峰面積（最大組按100%計）和種類數。

首先，對水解時的pH進行了探究，結果見圖1。結果表明：當pH＞3時，水解后檢測到的香氣物質總峰面積基本上是pH≤3時的一半，香氣物質種類也要少；在pH 1、2、3水解后檢測到的香氣物質總量相差不大，香氣物質的種類均為27種。因此本實驗中選取了pH 3作為優化后的條件。

水解時間對釋放香氣物質的影響結果見圖2。水解30 min時，釋放香氣物質的總量已達到平衡，而且此時得到香氣物質的種類也達到最多，為27種，因此選擇水解30 min為最優水解時間。綜合結果可得，最佳的前體物質水解條件為：pH 3、30 min。

圖1 pH值對釋放香氣物質的影響Fig.1 Effect of pH on the release of aroma compounds

圖2 水解時間對釋放香氣物質的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the release of aroma compounds

2.2 釀造原料中結合態香氣物質的分析

經過有機溶劑萃取、旋蒸、水溶、固相萃取（SPE）等步驟，分別提取了高粱、玉米、大麥、小麥、大米、糯米等6種釀造原輔料中結合態香氣物質的前體。水解后，應用HS-SPME結合GC-MS技術對結合態香氣物質進行分析，共定性定量了35種香氣化合物，見表1。這些物質基本上均在在白酒中有檢測到[15-16]，包括α-萜品醇、β-大馬酮等微量成分。

酯類化合物：白酒中含量最為豐富的一類化合物，在原料中共檢測到了己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、棕櫚酸乙酯等3種酯類結合態酯類物質，但是含量不是很多。

醇類化合物：醇類物質是酒中重要的呈香物質，原料結合態香氣物質中共檢測到4種醇類物質，分別是3-甲基-1-丁醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇和1-辛醇。其中 1-己醇的質量分數在288.69～399.42 μg/kg，是質量分數較多的一種醇類物質；1-辛烯-3-醇具有淡淡的蘑菇香氣[17]，是比較特殊的一種醇類，質量分數在52.01～132.18 μg/kg。

酸類化合物：酸類物質都是和醇類反應生成酯的前驅物，共檢測到戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、E-2-辛烯酸6種酸類物質。壬酸的平均質量分數最高，為123.58 μg/kg。其次是己酸和辛酸，E-2-辛烯酸在汾酒中雖有過報道[15]，但是卻沒有進行定量分析，幾種原料中的質量分數為14.83～123.95 μg/kg。

醛酮類化合物：醛酮類物質是結合態香氣物質中種類及含量最多的一類化合物，平均占到所有結合態香氣物質含量的38%左右。在檢測到的10種醛酮類化合物中癸醛的質量分數最多，在185.22～259.76 μg/kg之間；1-辛烯-3-酮具有淡淡的蘑菇清香[18]，平均質量分數為35.47 μg/kg；反，反-2，4-壬二烯醛和反，反-2，4-癸二烯醛兩種二烯醛具有淡淡的脂肪香[19]，平均質量分數分別為111.65、58.41 μg/kg。

芳香族類化合物：芳香族類化合物可以使酒的口感更加和諧，共檢測到苯乙醛、苯甲醇、β-苯乙醇、苯酚等4種芳香族類物質。其中β-苯乙醇具有玫瑰韻味[20]，而苯酚的質量分數最高，達210.82 μg/kg。

雜環類化合物：共檢測到2種雜環類結合態香氣物質，2-戊基呋喃和四甲基吡嗪，僅在高粱、豌豆、玉米中檢測到了四甲基吡嗪。

萜類化合物：萜類物質葡萄酒中重要的一類香氣物質，大部分以前體形式存在，在發酵及陳釀過程中逐漸釋放出來，近幾年來在白酒中也發現這類重要的化合物[21]。谷物類原料可以為酒提供里哪醇氧化物、α-柏木烯、α-萜品醇、β-大馬酮、香葉基丙酮、脫氫-β-紫羅蘭酮等6種萜烯類物質；香葉基丙酮的質量分數最多，平均為24.81 μg/kg，與清香型白酒相似。

將各原料中結合態香氣物質質量濃度進行Z標準化后制作熱圖，見圖3。可以看出，每種原料中結合態香氣物質質量濃度差別比較大。比如大麥中3-甲基-1-丁醇（序號4）的質量濃度非常高，而該物質是一種讓人“上頭”的高級醇，俗話說的“大麥沖”可能也有這方面的原因；而玉米中萜烯類物質（序號30-35）總體上均高于其他幾種原料，而這些萜烯類物質都具有甜甜的果香、花香，這就促成了“玉米甜”。

表1 釀造原料中結合態香氣物質的質量濃度Table 1 Bound aroma compounds in raw brewing materials

續表1

總之，這些結合態香氣物質在經過微生物酶促作用或者蒸餾作用，從前體釋放，構成了釀造產品的重要風味物質，這都證明了研究釀造原料中結合態香氣物質的重要性。

3 結語

圖3 6種釀造原料中結合態香氣物質質量濃度熱圖Fig.3 Heat map of bound aroma compounds in 6 raw brewing materials

釀造原料中含有一些以前體形式存在的結合態香氣物質，這些香氣物質會在發酵過程或者蒸餾過程中釋放出來，成為釀造產品風味的組成部分，不同原料中結合態香氣物質的種類和質量濃度均有差別。作者建立了一種釀造原料中結合態香氣物質的提取方法，并結合頂空固相微萃取與氣象質譜聯用技術對其進行了定性定量分析，方法簡單、實用。利用該方法對釀造原料中的結合態香氣物質進行分析，可以成為篩選原料的一種新的手段，為今后深入的研究原料與酒之間的品質關系和質量控制提供了技術支持。

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Isolation and Analysis of Bound Aroma Compounds in Different Raw Brewing Materials

ZHU Weian1，2， WU Qun1，2， LI Jiming2， XU Yan*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Raw cereal materials are the basis for Chinese liquor making，which determine the quality of liquor.In order to have a better understanding of aroma compounds in raw brewing materials，the bound aroma compounds which exist in the style of precursors were analyzed in this study.The precursors could be got from several processes：extraction with organic solvent，dryness with rotary evaporator in vacuo，and SPE.The free compounds were released from precursors after acid hydrolysis.Then these bound aroma compounds were investigated by HS-SPME-GC-MS.In this study，bound aroma compounds in 6 cereals were analyzed and the total of 35 bound aroma compounds were identified and quantified，including 4 kinds of alcohols，3 kinds of esters，10 kinds of ketones and aldehydes，6 kinds of acids，4 kinds of aromatic compounds，6 kinds of terpenoids，and 2 kinds of heterocycle compounds.

brewing materials，bound aroma compounds，SPE，HS-SPME，GC-MS

TS 261

A

1673—1689（2015）05—0456—07

2014-02-08

國家863計劃項目（2012AA021301，2013AA102108）；國家自然科學基金項目（31000806，31371822，31271921）；2011協同創新計劃。

*通信作者：徐 巖（1962—），男，浙江慈溪人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事酶工程與發酵工程方面的研究。

E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn