干預Hedgehog信號對腎小管上皮細胞增殖細胞核抗原表達的影響

陸紅，吳蓮鳳，林成成，王斯璐，梁勇，白永恒

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1．醫學檢驗中心；2．外科實驗室）

Hedgehog（HH）信號最早是在研究果蠅基因突變中被發現，主要由配體sonic hedgehog（Shh）、膜受體Patched 1（Ptch1）、信號開關蛋白Smoothened（Smo）及下游的轉錄因子Gli1組成[1]。在整個信號通路中，Shh、Smo及Gli1為正調節作用，而Ptch1則起著負調節作用。最近有研究報道，持續異常激活的HH信號可導致胰腺癌、器官纖維化等多種增殖性疾病的發生[2-3]。我們前期研究發現，HH信號參與了腎間質纖維化過程，誘導腎小管上皮細胞發生表型轉化和基質累積[4-5]，然而，其機制目前尚不清楚。因此，本研究擬通過外源性重組蛋白Shh來活化HH信號，以及環杷明特異性阻斷HH信號的活化，檢測腎小管上皮細胞增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表達改變，旨在從體外實驗角度觀察調控HH信號對細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM細胞培養液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶和TRIzol提取液（美國Gibco公司）；兔抗鼠Ptch1、Smo、Gli1和PCNA單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；RT-PCR試劑（美國Promega公司）；重組蛋白Shh和環杷明（美國PeproTech公司）；MyCycler梯度PCR儀（美國Bio-Rod公司）；7500定量PCR儀（美國Applied Biosystens公司）；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀（美國Thermo Scientific公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：大鼠腎小管上皮細胞系（NRK-52E）購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養條件為5%胎牛血清的DMEM培養液，置于37 ℃，5% CO2培養箱。實驗前，調整細胞至適當密度并鋪板于六孔板中，當細胞融合度為50%～70%時，開始正式實驗。設立組別：對照組：不加入Shh和環杷明；活化組：細胞培養基中加入10μg/L Shh；干預組：在10μg/L Shh基礎上，加入5μmol/L環杷明。各組細胞培養24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。

1.2.2 real-time RT-PCR檢測mRNA表達：采用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，根據RT-PCR試劑說明書將RNA反轉錄成cDNA。針對Ptch1和Smo mRNA設計特異性引物，以β-actin作為內參，采用real-time RT-PCR相對定量法進行檢測。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取反轉錄產物1μL進行定量PCR，PCR擴增體系：5μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、上下游引物各1μL，終濃度為200 nmol/L、1μL cDNA、2μL反應緩沖液。擴增程序為：95 ℃5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40個循環。通過熔解曲線評價PCR結果可靠性，采用2-△△Ct計算相對mRNA表達量。△△Ct=[Ct目的基因（待測樣品）-Ct內參（待測樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內參（校正樣品）]。

表1 擴增Ptch1和Smo mRNA特異性引物

1.2.3 細胞免疫熒光檢測HH信號和PCNA蛋白表達：取對數生長期NRK-52E細胞，分別加入溶劑，10μg/L Shh和10μg/L Shh基礎上加入5μmol/L環杷明進行爬片培養24 h，吸去培養液，4%甲醛固定，用含0.03% Triton X-100的PBS對細胞進行破膜。5%二抗血清封閉孵育，行一抗孵育與二抗孵育，用DAPI進行核染，封片劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察并圖像獲取Ptch1、Smo、Gli1和PCNA的表達情況。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件包進行統計學分析。結果以 ±s表示，兩樣本比較采用t檢驗和精確概率法，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組蛋白Shh及環杷明對HH信號的影響 細胞免疫熒光染色結果顯示，對照組細胞中Ptch1表達較高，Smo和Gli1表達較低，提示HH信號活性較低。應用10μg/L Shh作用NRK-52E細胞24 h后，Ptch1蛋白表達顯著下降，而Smo和Gli1蛋白表達顯著升高，見圖1。Real-time RT-PCR結果也顯示，Ptch1 mRNA表達下降，Smo mRNA表達升高（見表2）。這些結果提示HH信號通路被Shh活化。用環杷明進行干預后，Ptch1表達升高，Smo和Gli1表達下調（見圖2）。此外，Ptch1 mRNA表達量也顯著上調，而Smo mRNA表達下調（見表2）。因此，Shh誘導NRK-52E細胞中HH信號的活化，可被環杷明所阻滯。

2.2 重組蛋白Shh及環杷明對PCNA表達的影響PCNA作為細胞增殖最重要的標志物之一，主要定位表達于細胞核中。對照組NRK-52E細胞中PCNA的表達水平較低（見圖2a和2a’），而活化組細胞表達PCNA蛋白的水平明顯上調（見圖2b和2b’）。此結果提示，Shh活化HH信號后，可引起細胞增殖性反應。加入環杷明后，抑制了由Shh所致的PCNA高表達（見圖2c和2c’）。此外，我們也發現，原本核染位置的PCNA也游離到胞漿之外，這提示環杷明可誘導NRK-52E細胞出現凋亡、壞死等形態學改變。

圖1 重組蛋白Shh及環杷明對HH信號的影響（×400）

圖2 活化和阻斷HH信號對NRK-52E細胞PCNA的影響（×400）

2.3 活化和抑制HH信號對NRK-52E細胞增殖的影響倒置相差顯微鏡下，正常的腎小管上皮細胞相互重疊生長，呈鋪路石狀；當重組蛋白Shh作用后，腎小管上皮細胞數量增加的同時細胞形態變得不規則，且細胞邊界明顯；而當環杷明對活化組進行干預后，細胞變大，細胞數量減少且間隙變寬，細胞間甚至形成空洞，見圖3。這些結果提示活化HH信號對細胞增殖的影響不僅僅是細胞數目的增加，而且細胞形態也發生改變，如表型轉化。

表2 各組間Ptch1和Smo mRNA表達量的比較（n=6， ±s）

3 討論

HH信號是一條高度保守的信號通路，在哺乳動物中，HH信號通路對于器官發育、維持成熟組織的內環境穩定、慢性炎癥中的組織修復和癌癥發生等多種進程發揮著十分重要的作用[6]。

圖3 活化和阻斷HH信號對NRK-52E細胞增殖的影響（×400）

國外研究發現，在梗阻性膽管疾病中，HH信號可被活化，進而促進膽管上皮細胞表型轉化，最終導致膽管組織纖維化的發生[3]。我們前期研究也顯示，HH信號參與了腎間質纖維化過程[4-5]。在體外，馬兜鈴酸可誘導腎小管上皮細胞表達和釋放TGF-β1，促進上皮細胞向間質細胞轉化，從而導致基質成分I和III型膠原的過度累積[4]。在體內，輸尿管梗阻引起了腎小管上皮細胞的表型轉化，進而導致間質纖維化的發生[5]。在這些過程中，HH信號均被激活[7]。然而，HH信號如何調控小管上皮細胞的表型轉化，其分子機制尚不十分清楚。Mill等[8]研究顯示，活化的HH信號能夠上調其轉錄靶蛋白Cyclin E和Cyclin D的表達，后兩者加快細胞G/S期的轉變，誘導細胞過度增殖和表型轉化。本研究中，我們通過人為誘導HH信號的活化，發現PCNA表達顯著增加。PCNA為細胞增殖信號相對較下游的標志物，其表達水平提高，意味著細胞過度增殖。這種增殖不僅表現為腎小管上皮細胞數目的增加，而且細胞形態上也發生了改變。我們推測，在損傷微環境中，多種因素可誘導HH信號的活化。活化的HH信號誘導自身或周圍的上皮細胞不僅通過正常增殖維持一定的細胞數量，而且也通過異常增殖方式，轉化為耐受力更強的肌成纖維細胞以維持生存[9]。這種增殖方式也就是由所謂的表型轉化而形成的肌成纖維細胞能分泌膠原成分在局部累積導致纖維化。

環杷明是一種從藜蘆屬植物內分離得到的異甾體類生物堿。環杷明可通過特異性改變Smo空間構象，抑制其活性，從而抑制HH信號通路[10]。此外，環杷明與Smo結合能夠使細胞的分裂停止于G0/G1期，誘導細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。本研究也證實了活化的HH信號可被環杷明所抑制，并且PCNA的表達也明顯下調。下調的PCNA與小管上皮細胞增殖的抑制密切相關，這結果也從形態學角度得到驗證。鏡下我們觀察到，環杷明抑制了細胞的增殖，并且誘導了細胞的凋亡壞死。

綜上所述，通過干預HH信號，可以調控PCNA的表達，進而影響細胞增殖效應。然而，這種不僅增加細胞數目，而且也誘導細胞發生表型轉化的增殖性調控機制還需今后的研究加以論證。

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