外源性激素對異種移植后人胎卵巢組織的影響

童月紅，周穎，吳丹丹，傅曉艷

（1.金華市中心醫院 婦產科，浙江 金華 321000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 生殖醫學中心，浙江溫州 325000；3.金華市職業技術學院 解剖學教研室，浙江 金華 321000）

卵巢組織冷凍移植技術的發展為保存女性的生殖及內分泌功能提供了可能。但卵巢組織的來源極為有限，無法滿足如卵巢早衰等患者的自體卵巢組織冷凍移植的需求。凍融人胎卵巢組織進行移植可成為解決這一問題的有效途徑，但將其應用于臨床尚需大量的實驗研究。本研究以裸鼠異體移植作為實驗模型，比較不同的外源性促性腺激素作用方式對凍融人胎卵巢組織異種移植后卵泡發育的影響，為其將來作為移植供體的可行性提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 經溫州醫科大學倫理委員會批準收集引產的女性胚胎卵巢（由溫州醫科大學附屬第一醫院分娩室提供，并與家屬簽署知情同意書）6例，胎齡為28～35周。本實驗選用雌性裸鼠（BACLB/CA/nu-nu，購自中科院上海實驗動物中心）54只，6～8周齡，體質量17～23 g，平均（20±3.15）g，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心。實驗動物按不同外源性促性腺激素給予方式（A、B、C）及不同時期（分別為10～14周、18～22周、26～30周）回收移植物分為9組，每組6只，共54只。

1.2 主要試劑 Leibovitz-15（購自Sigma公司），丙二醇（PROH）（購自Sigma公司），孕馬血清促性腺激素（PMSG）（購自寧波第二激素廠），人絨毛膜促性腺激素（hCG）（購自麗珠集團），Bolin固定液、增殖細胞核抗原（PCNA）試劑盒（由北京中杉金橋生物技術有限公司提供）。

1.3 方法

1.3.1 人胎卵巢組織的凍融：獲取的卵巢組織室溫下Leiboviz-15基礎培養液中切成約2 mm×3 mm×3 mm小塊，組織立即于Bolin液中固定為新鮮組。其余組織塊置于含1.5 mL PROH冷凍保護液的冷凍管中，采用Oktay等[1]提出的慢速冷凍快速復溫法操作，解凍后組織塊于Bolin液中固定為凍融組，其余組織切成約1 mm3大小用于移植，為移植組。

1.3.2 去勢及移植手術：腹腔麻醉后，去除裸鼠雙側卵巢，暴露腎臟，分別于雙側腎被膜下各移入1塊組織。凍融人胎卵巢組織異種移植后將實驗動物隨機分為3組（每組各18只），A組：移植術后4周開始每只隔日PMSG 5 IU經腹腔注射至取材；B組：取材前14 d開始每只隔日經腹腔注射PMSG 5 IU，直至取材，共7次；C組：移植術后4周開始等量0.9%氯化鈉溶液隔日經腹腔注射至取材。分別于術后10～14周、18～22周、26～30周回收移植物，取材前36 h腹腔注射hCG 5 IU，回收的移植物立即置于Bolin溶液中固定。

1.3.3 卵泡計數：新鮮和移植后取回的卵巢組織固定Bolin液中作石蠟包埋，連續切片，厚度5μm，用蘇木素-伊紅染色。按Gougeon[2]卵泡分類標準進行卵泡計數：單層扁平或扁平與立方混合的前顆粒細胞包繞卵母細胞為原始卵泡；單層立方形顆粒細胞包繞中間的卵母細胞為初級卵泡；兩層或以上立方形顆粒細胞包繞卵母細胞，無竇腔形成為次級卵泡；兩層以上的顆粒細胞，卵泡內有竇腔形成為竇卵泡。原始卵泡：高倍鏡400倍下隨機觀察10個視野，計數每隔10張切片中的卵泡數。初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡：分別計數所有切片中各階段卵泡總數。1.3.4 PCNA免疫組織化學分析：移植后回收的卵巢組織常規固定包埋，5μm連續切片，每隔10張切片取一張，按試劑盒說明進行免疫組織化學染色，蘇木素復染。結果判斷：PCNA定位于細胞核內，陽性呈棕褐色，陰性呈藍色。每張切片在400倍視野下計數5個視野，每個視野100個以上陽性細胞，計算陽性指數（陽性指數=視野內的陽性細胞數/視野內總細胞數×100%）。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計學軟件對數據進行分析。新鮮組和凍融組卵巢組織內卵泡計數以 ±s表示，采用配對樣本t檢驗，各移植組間卵泡計數及PCNA陽性指數則采用多組等級資料的Kruskal-Wallis秩和檢驗，如差異有統計學意義，再進一步進行3組樣本秩和的兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新鮮組和凍融組人胎卵巢組織形態學觀察

新鮮組及凍融組人胎卵巢組織中的卵泡均以原始卵泡為主，分布較均勻，絕大部分形態正常，部分原始卵泡的卵母細胞胞漿內有空泡形成，可見卵原細胞散在分布，未見初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡。凍融組的原始卵泡數量為（30.10±9.44）個，比新鮮組的（37.26±8.91）個少，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 移植組的檢測

2.2.1 移植物的存活：整個實驗中無動物死亡。取材時可見腎被膜下移植物凸出腎臟表面，體積不同程度增大，呈亮白色，部分可見透明竇狀小泡（見圖1）。A、B、C各組移植物回收率分別為88.9%（32/36）、86.1%（31/36）、88.9%（32/36），存活率分別為75.0%（27/36）、77.8%（28/36）、75.0%（27/36），3組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2.2 卵泡計數：3組移植物中的原始卵泡數與新鮮組及凍融組相比均減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。3組移植物隨著移植時間的延長，卵泡呈現原始卵泡數目減少及生長卵泡增加趨勢。A組：與10～14周相比，26～30周移植物中的原始卵泡數減少而次級卵泡數增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。B組：各時期原始卵泡數差異無統計學意義（P＞0.05）；與10～14周及18～22周相比，26～30周移植物中的初級卵泡數及次級卵泡數均增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。C組：各時期移植物中原始卵泡數及次級卵泡數變化差異無統計學意義（P＞0.05）；與10～14周相比，18～22周及26～30周移植物中的初級卵泡數增多，差異有統計學意義（P＜0.05）。

移植早期（10～14周）：A、B、C 3組均可觀察到初級卵泡（見圖2）及次級卵泡（見圖3）。移植中期（18～22周）：與移植早期相比，3組移植物中的原始卵泡數、初級卵泡數及次級卵泡數差異均無統計學意義（P＞0.05）；A、B 2組各觀察到2個和1個竇卵泡（見圖1-4）。移植晚期（26～30周）：同期B、C組移植物中的原始卵泡數較A組多，差異有統計學意義（P＜0.05）；3組移植物中的初級卵泡數比較差異無統計學意義；同期A、B組移植物中的次級卵泡數較C組多，差異有統計學意義（P＜0.05）；且此期A、B、C 3組分別可見1個、2個、1個竇卵泡。各組各期原始卵泡計數具體見表1，初級卵泡計數見表2，次級卵泡計數見表3。

2.2.3 PCNA的免疫組織化學檢測：3組的移植物中呈棕褐色的陽性細胞主要表達于初級卵泡、次級卵泡顆粒細胞及卵細胞核內；組織間質中也可見較多陽性表達細胞存在；偶見原始卵泡中體積增大、呈立方形的前顆粒細胞呈陽性表達（見圖5-6）。定位陽性表達細胞于初級卵泡、次級卵泡顆粒細胞及卵細胞核，A、B、C 3組移植物PCNA陽性指數分別為55%～88%、52%～85%、46%～80%，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

在卵巢組織的冷凍研究中，采用冷凍劑PROH及程序化冷凍法[3-4]，可獲得較為穩定的效果。本實驗結果也證實凍融后人胎卵巢組織中仍存大量的原始卵泡，移植后卵泡的生長及PCNA的良好表達也進一步證實組織功能的完整性。但本研究結果示人胎卵巢組織移植后喪失的原始卵泡達50%以上，與成年[5]及青春前期[6]的人卵巢組織相比有差距，如何提高移植后組織內的卵泡的數量我們將繼續研究。

表1 各組不同時期回收移植物中的原始卵泡數計數（ ±s，個）

表2 各組不同時期回收移植物中的初級卵泡計數（ ±s，個）

表3 各組不同時期回收移植物中的次級卵泡計數（ ±s，個）

圖1 回收的人胎卵巢組織（T示移植物，其中可見竇卵泡，K示裸鼠腎臟）

圖4 術后22周回收移植物內可見竇卵泡發育（HE，×200）

圖2 術后10周回收移植物內可見初級卵泡（HE，×400）

圖5 A組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

圖3 術后14周回收移植物內可見次級卵泡（HE，×400）

圖6 C組18周回收移植物的PCNA染色（×400）

人胎卵巢組織中存在的大量原始卵泡，且組織中所含較低的人類器官移植相關的抗原及較高的血管源性和神經源性因子，適用于異體移植。目前人胎卵巢研究的重要問題是促進更多數量卵泡的成熟發育及延長移植物存活時間。移植物的激素環境是影響卵泡發育的重要因素。既往關于外源性促性腺激素方案與異體移植后卵巢組織內卵泡發育的實驗結果存在矛盾，因研究物種及選擇激素作用方式的不同相關。Pisani等[7]在以SCID鼠為模型的豬卵巢同種異體移植實驗中，持續作用的外源性促性腺激素對卵泡的發育并沒有顯示出顯著作用；Gook等[8]卵巢異種移植中卻顯示外源性促性腺激素可促進組織中更多卵泡發育。為探索外源性促性腺激素對人胎卵巢組織異種移植的影響，本實驗設計了兩種不同的激素作用方式，一種是根據文獻報道所采用的外源性促性腺激素持續作用方式（即A組采用的方式），另一種是試圖模擬成人促排卵激素作用方式（即B組采用的方式）。實驗結果顯示，即使缺乏外源性促性腺激素作用，卵泡仍能發育至竇卵泡階段；不管何種作用方式，外源性促性腺激素對異種移植后人胎卵巢組織中卵泡生長的促進作用，不同于Pisani等[7]研究，與Gook等[8]結果類似，且外源性激素對初級卵泡以上的卵泡生長促進作用更為顯著。推測原因為異種移植的人胎卵巢組織中大部分為原始卵泡，該階段卵泡需經非激素依賴生長啟動階段，外源性促性腺激素持續作用主要作用于卵泡生長啟動后階段，對兩層顆粒細胞以上的卵泡起關鍵作用，故在卵泡生長啟動前階段其促生長作用是有限的。但本實驗觀察到，人胎卵巢組織長期移植后存在一定數量的生長啟動卵泡及初級卵泡，由于外源性促性腺激素持續作用和促排卵激素作用方式都主要作用于此類卵泡，故二者均獲得較好的卵泡發育結果。由于部分學者[9]認為外源性激素在卵巢移植過程中發揮促進顆粒細胞的有絲分裂及抑制凋亡的作用，同時對卵巢間質細胞分化起作用[10]，因此盡管外源性促性腺激素持續作用與促排卵激素作用方式沒有差別，所以有學者仍建議長期采用該方式。但本實驗中兩種激素作用方式下的PCNA陽性差異也不明顯。又有學者[11]提出，外源性促性腺激素的長期使用會大量消耗移植組織內原始卵泡儲備，造成移植物維持時間的縮短。本實驗還觀察到，移植后期外源性促性腺激素持續作用后組織中的原始卵泡數下降，而促排卵激素作用方式下的組織中原始卵泡數變化相對不明顯。故雖兩種激素作用者均可獲得較好的卵泡發育結果，但促排卵激素作用方式對原始卵泡儲備造成的影響可能更小。

綜上所述，去勢的雌性裸鼠體內的促性腺激素水平已達卵泡發育所需，外源性促性腺激素持續作用方式及促排卵激素用方式均可進一步促進異種移植后凍融人胎卵巢組織中卵泡的發育。但本實驗最終均未見黃體組織，需考慮移植后組織中的竇卵泡是否存在成熟及排卵障礙，而不同的激素作用方式對卵子質量[12]的影響等問題均需進一步研究闡明。

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