癌蛋白PRC17與人肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈相互作用的初步鑒定

何澤，陳洋，張永臣，萬青，趙虎子，趙蕾，沈傳陸

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇南京 210009)

PRC17即前列腺癌基因17，也稱TBC1D3，是人類特有的基因，該基因在15%的前列腺癌中高擴增，并且在50%轉(zhuǎn)移性前列腺癌中過表達。因為PRC17促進細胞增殖并且能使NIH3T3細胞惡性轉(zhuǎn)化而被鑒定為癌基因［1］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PRC17能夠延遲表皮生長因子受體(EGFR)和胰島素受體底物-1(IRS-1)的降解，增強和延長信號活性來促進細胞增殖。PRC17能抑制EGFR對C-卡西塔斯B細胞淋巴瘤蛋白(c-Cbl)的募集，減少EGFR的多泛素化，從而延遲EGFR降解［2］。PRC17對胰島素信號的調(diào)節(jié)通過激活蛋白磷酸酶2(PP2A)途徑完成。激活的PP2A通過抑制核糖體蛋白S6激酶活性，而下調(diào)IRS-1上能夠被Cul7泛素連接酶識別的磷酸化位點，最終延遲IRS-1的降解［3］。另外，PRC17能與 ADP核糖基化因子6(Arf6)一起同時結(jié)合高爾基關(guān)聯(lián)的含γ銜接蛋白耳的ARF結(jié)合蛋白3(GGA3)，一起協(xié)作促進細胞的巨胞飲內(nèi)吞［4］。

為了進一步研究PRC17的功能，我們嘗試尋找新的與PRC17結(jié)合的蛋白。前期的實驗工作證明MLC2能夠與轉(zhuǎn)染重組轉(zhuǎn)化因子(Tre17)結(jié)合［5］，而Tre17與PRC17具有相似的TBC結(jié)構(gòu)域，并且PRC17與Tre17氨基端的序列達到了89%的一致性［6］，推測PRC17與MLC2很可能相互作用。鑒定PRC17與MLC2之間的相互作用將為進一步研究PRC17及MLC2的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 SMMC-7721細胞為作者所在實驗室保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 菌種E.coli DH 5a和BL21、原核表達載體質(zhì)粒pGEX-6P-1、真核表達載體pcDNA-3.0-HA為作者所在實驗室保藏。重組載體pcDNAHA-PRC17、pcDNA-HA-PRC17(353)和 pcDNA-HAPRC17(251)由作者所在實驗室以前成功構(gòu)建并保存，分別用于SMMC7721細胞表達PRC17、PRC17氨基末端的353和251個氨基酸片段。pcDNA-HA-PRC17(164)和pcDNA-HA-PRC17(Δ164)為本次構(gòu)建，分別用于細胞表達PRC17氨基端的164個氨基酸或氨基端164個氨基酸缺失的PRC17突變體。

1.1.3 試劑與抗體 限制性內(nèi)切酶(Bam HⅠ、Eco RⅠ等)、T4DNA連接酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶購自大連TaKaRa生物有限公司，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自金斯瑞生物科技有限公司，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司，凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen公司，抗生素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自南京鼎國生物工程公司，Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare公司，抗-GST抗體購自Cell Signal公司，抗-HA抗體和HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Thermo SIENTIFIC公司，轉(zhuǎn)染試劑 LipoD293TMReagent購自 SignaGen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SMMC-7721細胞用含10%小牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 U·L-1青霉素和100μg·L-1鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2中37℃培養(yǎng)。

1.2.2 PCR擴增 根據(jù)PRC17基因全長cDNA序列(GeneID:729873)，以pcDNA-HA-PRC17為模板，設(shè)計擴增 PRC17(164)和 PRC17(Δ164)的引物:PRC17(164)上游引物ATGTTCCAGATTACGCTTCTA，PRC17(164)下游引物 CTGAATTCCGTATCGATCCCTG，PRC17(Δ164)上游引物TAGGATCCACCACCATGACC AAGCAGCGGGAAC，PRC17(Δ164)下游引物 CTGGCA ACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCA。擴增條件:預(yù)變性94℃ 2 min;變性98℃ 10 s，退火55℃ 10 s，延伸72℃ 1 min，35個循環(huán);總延伸72℃ 7 min。

1.2.3 PRC17突變體表達載體的構(gòu)建 PCR擴增的PCR產(chǎn)物PRC17(164)和PRC17(Δ164)經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，然后通過凝膠回收試劑盒回收，PRC17(164)、PRC17(Δ164)和載體pcDNA-HA分別經(jīng)過相應(yīng)的雙酶切后用凝膠回收試劑盒回收，然后載體與目的DNA片段按照1∶3的比例混合，用T4DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5a感受態(tài)細胞后，置于搖床，37℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，涂布于含100μg·min-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后對陽性克隆進行測序鑒定。

1.2.4 GST融合蛋白的原核表達和純化 GSTMLC2融合蛋白的原核表達和純化主要見參考文獻［7-9］。即挑取表達GST-MLC2的單菌落于氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按照1∶100比例轉(zhuǎn)接種于10 ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基OD600nm為0.6～0.8之間，用 0.1 mmol·L-1的 IPTG，在 30 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6 h。經(jīng)過裂解液及超聲處理，離心后通過 Glutathione Sepharose 4B吸附上清液中的GST融合蛋白，裂解液清洗3遍并離心棄上清獲得純化蛋白。SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色，拍照后通過灰度分析確定目的蛋白的純度。

1.2.5 GST沉淀實驗分析 在每35 mm皿中接種3×105SMMC-7721細胞培養(yǎng)20 h，pcDNA-HA-PRC17、pcDNA-HA-PRC17(353)、pcDNA-HA-PRC17(251)、pcDNA-HA-PRC17(164)和 pcDNA-HA-PRC17(Δ164)被分別轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細胞，24 h后將細胞于冰上，PBS洗2遍后每皿加150μl裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl，pH 7.5，0.5%Triton X-100，150 mmol·L-1氯化鈉，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸，10 mmol·L-1氟化鈉，1 mmol·L-1正釩酸鈉，1 mmol·L-1PMSF，5μg·ml-1抑肽素，5 μg·ml-1亮抑酶肽，2 μg·ml-1抑蛋白酶肽)裂解10 min。4℃、12 000 r·min-1離心20 min得上清液，留取上清液的1/10作為全細胞裂解物(WCL)，剩下的裂解物上清分別與5μg純化的GST-MLC2樹脂混合，4℃旋轉(zhuǎn)混勻4 h，GST則作為陰性對照。然后裂解液洗3遍后，離心棄上清，沉淀用1倍的樣品緩沖液重懸后于沸水中煮5 min，樣品通過蛋白質(zhì)印跡法檢測分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 蛋白樣品通過SDSPAGE電泳分離后，用250 mA恒流轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，然后PVDF膜用含2%BSA的TBST室溫封閉1 h，加一抗抗體4℃過夜標(biāo)記，TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫標(biāo)記1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯色觀察分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PRC17截短突變體的構(gòu)建和鑒定

構(gòu)建的pcDNA-HA-PRC17(164)質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切后，出現(xiàn)502 bp大小的特征性片段;pcDNA-HA-PRC17(Δ164)質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現(xiàn)1 173 bp大小的特征性片段(圖1)。DNA序列測定證實上述PRC17截短突變體序列無誤。

圖1 PRC17截短突變體重組表達載體的酶切鑒定Fig 1 Identification of recombinant plasmid expressing truncated PRC17 mutant by restriction enzyme digestion M.DNA ladder;Lane 1.pcDNA-HA-PRC17 digested with Bam HⅠand Eco RⅠ;Lane 2.pcDNA-HA-PRC17(164)digested with Bam HⅠ and Eco RⅠ;Lane 3.pcDNA-HA-PRC17(Δ164)digested with Bam HⅠ and XhoⅠ

2.2 GST-MLC2融合蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

轉(zhuǎn)化pGEX-MLC2或空載體pGEX-6p-1的BL21細菌經(jīng)0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)6 h后細菌裂解，裂解物上清經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和層析純化。SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，純化的GST和GST-MLC2蛋白分子質(zhì)量分別約為28.4 kD和46.6 kD，符合預(yù)期;兩種蛋白的純度均在95%以上(圖2)，GST和GST-MLC2蛋白均得到了很好的表達與純化。

2.3 PRC17與MLC2相互作用的分析

為了分析PRC17與MLC2之間的相互作用，我們將PRC17及其一系列氨基酸片段缺失突變體分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞，以GST蛋白為對照，與純化的GST-MLC2進行GST沉淀分析。結(jié)果顯示，PRC17及其突變體都能在SMMC-7721中表達(圖3、圖4B)。并且PRC17明顯結(jié)合MLC2而不結(jié)合陰性對照GST(圖4C)，說明PRC17能特異性結(jié)合MLC2。與全長PRC17相似，突變體PRC17(353)和PRC17(251)均能有效結(jié)合MLC2，相反，PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能與MLC2結(jié)合(圖4)。這些結(jié)果提示PRC17蛋白序列上與MLC2結(jié)合的部位位于其氨基端251位氨基酸之內(nèi)，可能在164位氨基酸附近。

圖2 GST和GST-MLC2純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis of purified GST-MLC2andGST protein M.protein marker;Lane 1.purified GST-MLC2;Lane 2.purified GST

圖3 PRC17及其截短突變體示意圖Fig 3 Schematic illustration of full-length wild type PRC17 truncated mutant

圖4 PRC17與MLC2相互作用及PRC17蛋白序列上結(jié)合位點的鑒定Fig 4 Identification of the interaction between PRC17 and MLC2 and the MLC2-binding site on PRC17 A.Western blot analysis of purified GST and GST-MLC2;B.Whole cell lysate of SMMC-7721 cells expressing PRC17 mutants respectively were tested by Western blot;C.GST-pull down was performed to test the interaction between MLC2 and PRC17 or its truncated mutants

3 討 論

人類的DNA中有一些基因是其它物種所沒有的，這些獨有的基因是區(qū)別人類與其它物種的基礎(chǔ)，但是人們對他們還了解甚少。PRC17作為一個人類特有的癌基因，相關(guān)的研究雖然已經(jīng)有所進展，但它的功能及其調(diào)節(jié)機制都不清楚。我們通過PRC17與TRE17的同源性預(yù)測與TRE17結(jié)合的MLC2可能也與PRC17相互作用，并通過實驗證明PRC17與MLC2之間結(jié)合，為下一步研究它們相互作用的功能打下了基礎(chǔ)。

首先，PRC17參與了對細胞巨胞飲的調(diào)節(jié)。巨胞飲是在某些因素刺激下，細胞膜皺褶形成直徑為0.5～2μm大的內(nèi)吞泡的過程，是非選擇性內(nèi)吞細胞外液相大分子和營養(yǎng)物質(zhì)的有效途徑。最新的研究顯示，巨胞飲途徑可能是腫瘤細胞獲得氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)促進腫瘤生長的重要途徑，通過藥物抑制巨胞飲途徑可以切斷腫瘤的營養(yǎng)供給，阻礙腫瘤的生長［10］。巨胞飲整個過程需要肌動蛋白的參與［11］。肌球蛋白Ⅱ由一對重鏈和兩對輕鏈組成，輕鏈在肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的作用下發(fā)生磷酸化，使重鏈的構(gòu)象變化暴露出與肌動蛋白的結(jié)合位點，調(diào)節(jié)細胞的運動等生理功能。研究表明，MLCK抑制劑ML-7能顯著抑制細胞膜皺褶的運動及巨胞飲體的產(chǎn)生［12］，這也意味著肌球蛋白輕鏈參與了細胞巨胞飲的過程。PRC17與MLC2之間的相互作用在細胞巨胞飲過程中的功能和機制有待我們進一步研究。

另外，作為肌球蛋白的重要組成部分，肌球蛋白輕鏈參與了許多重要的生理功能，包括細胞的遷移、細胞質(zhì)分裂及細胞形態(tài)的改變［13-17］。研究顯示，MLC2也參與了癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化可以阻擾癌細胞的侵襲［18-20］。一些蛋白通過與MLCK或MLC的相互作用影響肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而參與對癌細胞侵襲的調(diào)節(jié)。人ARD1(hARD1)與MLCK相互作用后能使激活的MLCK被乙?；Щ?，導(dǎo)致MLC磷酸化的減弱，并抑制腫瘤細胞的侵襲［21］。肌纖維生成調(diào)節(jié)因子-1(MR-1)則與MLC2相互作用，促進細胞的增殖和遷移［19］。PRC17與MLC2之間的相互作用是否調(diào)節(jié)著MLC2的磷酸化并繼而影響細胞惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有待進一步研究。

［1］PEI L，PENG Y，YANG Y，et al.PRC17，a novel oncogene encoding a Rab GTPase-activating protein，is amplified in prostate cancer［J］.Cancer Res，2002，62(19):5420-5424.

［2］WAINSZELBAUM M J，CHARRON A J，KONG C，et al.The hominoid-specific oncogene TBC1D3 activates Ras and modulates epidermal growth factor receptor signaling and trafficking［J］.JBiol Chem，2008，283(19):13233-13242.

［3］WAINSZELBAUM M J，LIU J，KONG C，et al.TBC1D3，a hominoid-specific gene，delays IRS-1 degradation and promotes insulin signaling by modulating p70 S6 kinase activity［J］.PLoSOne，2012，7(2):e31225.

［4］FRITTOLI E，PALAMIDESSI A，PIZZIGONI A，et al.The primate-specific protein TBC1D3 is required for optimal macropinocytosis in a novel ARF6-dependent pathway［J］.Mol Biol Cell，2008，19(4):1304-1316.

［5］楊永剛，田田，郭丹，等.細胞骨架蛋白肌球蛋白輕鏈與癌蛋白TRE17相互作用的鑒定［J］.南通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2008，28(2):82-84.

［6］PAULDING C A，RUVOLO M，HABER D A.The Tre2(USP6)oncogene is a hominoid-specific gene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(5):2507-2511.

［7］陳洋，何澤，張永臣，等.人肌球蛋白調(diào)節(jié)性輕鏈的原核表達及純化［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2013，32(4):408-412.

［8］沈濤，許曉軍，李妍，等.GST-hCAP融合蛋白表達載體的構(gòu)建及其在原核細胞中的表達［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，31(1):24-28.

［9］張紅艷，李彥姝，姚遠，等.pGEX-5X-1-hLMO4原核質(zhì)粒構(gòu)建及重組蛋白表達［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，31(2):139-143.

［10］COMMISSOC，DAVIDSONSM，SOYDANER-AZELOGLU R G，et al.Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells［J］.Nature，2013，497(7451):633-637.

［11］SWANSON JA，WATTSC.Macropinocytosis［J］.Trends Cell Biol，1995，5(11):424-428.

［12］ARAKI N，HATAE T，F(xiàn)URUKAWA A，et al.Phosphoinositide-3-kinase-independent contractile activities associated with Fcgamma-receptor-mediated phagocytosis and macropinocytosis in macrophages［J］.J Cell Sci，2003，116(Pt 2):247-257.

［13］KOSAKO H，YOSHIDA T，MATSUMURA F，et al.Rho-kinase/ROCK is involved in cytokinesis through the phosphorylation of myosin light chain and not ezrin/radixin/moesin proteins at the cleavage furrow［J］.Oncogene，2000，19(52):6059-6064.

［14］王叢陽，王輝，沈傳陸.肌球蛋白輕鏈的調(diào)節(jié)及其對腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(21):3251-3254.

［15］OLAZABAL I M，MACHESKY L M.Abp1p and cortactin，new"hand-holds"for actin［J］.J Cell Biol，2001，154(4):679-682.

［16］THAIPARAMBIL J T，EGGERSC M，MARCUS A I.AMPK regulates mitotic spindle orientation through phosphorylation of myosin regulatory light chain［J］.Mol Cell Biol，2012，32(16):3203-3217.

［17］MIZUTANI T，HAGA H，KOYAMA Y，et al.Diphosphorylation of the myosin regulatory light chain enhances the tension acting on stress fibers in fibroblasts［J］.JCell Physiol，2006，209(3):726-731.

［18］KANEKO K，SATOH K，MASAMUNE A，et al.Myosin light chain kinase inhibitors can block invasion and adhesion of human pancreatic cancer cell lines［J］.Pancreas，2002，24(1):34-41.

［19］REN K，JIN H，BIAN C，et al.MR-1 modulates proliferation and migration of human hepatoma HepG2 cells through myo-sin light chains-2(MLC2)/focal adhesion kinase(FAK)/Akt signaling pathway［J］.J Biol Chem，2008，283(51):35598-35605.

［20］UMEDA D，YAMADA K，TACHIBANA H.H89(N-［2-(p－bromocinnamylamino)ethyl］-5-isoquinolinesulfonamide)induces reduction of myosin regulatory light chain phosphorylation and inhibits cell proliferation［J］.Eur J Pharmacol，2008，590(1-3):61-66.

［21］SHIN D H，CHUN Y S，LEE K H，et al.Arrest defective-1 controls tumor cell behavior by acetylating myosin light chain kinase［J］.PLoSOne，2009，4(10):e7451.