人轉錄因子sp1在大腸桿菌中的表達與體外純化

王琪煒，陳寶俊，強倩，李淑鋒

(1.東南大學生命科學研究院，江蘇南京 210018;2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院心胸外科，江蘇南京 210008;3.東南大學醫學院生物化學與分子生物學系，江蘇南京 210009)

許多重要的生命活動是由含有鋅指結構域(zinc finger motif)的轉錄因子所調控的［1-2］，sp1(specific protein 1)就是這種類型的一種重要轉錄因子［3］。sp1蛋白的C端區域含有3個連續的鋅指結構域，這一區域能夠特異性地識別并結合GC-rich的啟動子區域，從而調節基因的轉錄。它識別的DNA核心結合序列為 GGCGGGG［4］。

sp1最初是作為Hela細胞抽提物中具有體外轉錄活性的組分而被發現的［5］，后來的研究證明sp1在組織中的分布很廣泛而且能夠調控許多的靶基因［6-7］。通常情況下，受其調控的靶基因多為細胞增殖、細胞分化、細胞生長等相關的基因［8-10］。更為重要的是，sp1在一些腫瘤中的表達水平明顯異常［11-13］。

為了研究sp1在基因表達中的調控作用，我們在原核系統中表達sp1蛋白并進行純化。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28b質粒，大腸桿菌Top10、BL21(DE3)菌株由作者所在實驗室保存;含人sp1 cDNA的真核表達質粒pCMV-sp1購自Addgene;DNA分子質量標準，蛋白質分子質量標準，限制性內切酶Eco RⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;PCR試劑及Agarose Gel快速純化試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司;IPTG、尿素、蔗糖等化學試劑購自上海生工生物工程股份有限公司;Ni-IDA親和層析填料購自Pharmarcia公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的亞克隆 將人源sp1真核表達質粒pCMV-SP1用限制性內切酶Eco RⅠ-XhoⅠ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收約2 200 bp的片段，即為sp1-699c(88-786 aa)的cDNA。再用T4DNA連接酶將回收后的雙酶切片段連接到用Eco RⅠ-XhoⅠ雙酶切并回收后的pET-28b質粒，連接產物轉化大腸桿菌Top 10感受態菌株，卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆，挑取單克隆進行酶切鑒定后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。用經測序后完全正確的菌落提取重組質粒。

1.2.2 融合蛋白在BL21(DE3)中的誘導表達與菌體收集 用經測序后確認正確的重組質粒pET28b-sp1-699c轉化BL21(DE3)感受態菌株，卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆，挑取單克隆于含有卡那霉素的3 ml LB培養基，37℃振蕩過夜，吸取1 ml過夜培養菌液于100 ml含卡那霉素的LB培養基中，37℃繼續搖菌，培養至OD600nm達到0.8時，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，18℃誘導12 h，離心收集菌體，與0 h時的菌體同時進行SDS-PAGE分析。將表達菌體重懸于5 ml預冷的裂解緩沖液(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2)，冰上超聲破碎，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，將離心后的上清和沉淀取樣進行SDS-PAGE分析。

1.2.3 包涵體中目的蛋白的變復性 將超聲離心后的沉淀重懸于5 ml預冷的1 mol的蔗糖溶液，反復吹打，充分混勻，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，棄上清，再將沉淀重懸于10 ml預冷的Triton-EDTA洗滌液(2%Triton X-100，10 mmol·L-1EDTA)，反復吹打，充分混勻，4℃放置12 h后，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，棄上清，用5 ml 8 mol的尿素溶液重懸沉淀，用1 L 透析液 A(4 mol·L-1尿素，30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h，再用1 L透析液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h。收集袋內液，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 可溶性目的蛋白的純化 裝填Ni-IDA層析柱，當柱床約2 cm高時，用3 ml緩沖液D(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，500 mmol·L-1咪唑)洗去 Ni-IDA 上的雜蛋白，再用15 ml的緩沖液A(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol· L-1NaCl，0.05 mmol· L-1ZnCl2，10 mmol·L-1咪唑)平衡柱床，之后將透析后的袋內液上清上樣，用4 ml的緩沖液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol· L-1ZnCl2，50 mmol·L-1咪唑)洗去雜蛋白，最后用緩沖液C(30 mmol· L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol· L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，250 mmol·L-1咪唑)洗脫含His-tag的目的蛋白，收集洗脫峰。取樣進行SDS-PAGE分析。

2 結 果

2.1 原核表達質粒pET28b-sp1-699c的構建

sp1的真核表達質粒pCMV-sp1圖譜如圖1所示，pCMV-sp1可在真核細胞內表達1-87aa deleted的sp1蛋白，即C端699aa的sp1變體蛋白。我們將這一段編碼序列用Eco RⅠ和XhoⅠ切開連入pET-28b載體。

圖1 sp1真核表達質粒p CMV-sp1圖譜Fig 1 Schematic diagram of the sp1's eukaryotic expression plasmid

重組質粒酶切鑒定結果如圖2所示，其中長度約5.3 kb的片段為pET28b載體，長度約2.2 kb的片段為人源sp1-699c的cDNA片段。

圖2 重組質粒p ET28b-sp1-699c酶切鑒定電泳結果Fig 2 Electrophoresis result of double-enzyme-cutting identification about recombination plasmid M.DNA marker;1.Recombination plasmid;2.Double-enzyme-cutting fragments

2.2 融合蛋白His-sp1的誘導表達與純化

經SDS-PAGE分析，如圖3所示，融合蛋白的分子質量約為91 kD，與理論值相符，且在菌體中實現了高效表達，但是主要仍為不可溶的包涵體形式，欲獲得較高濃度的目的蛋白，還需將包涵體經高濃度尿素變性，使之溶解，再通過透析去除尿素，使目的蛋白復性，最后利用融合蛋白N端的His-Tag與鎳柱親和層析，一步純化獲得目的蛋白。

圖3 大腸桿菌表達的融合蛋白SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE of fusion protein expressed by E.coli M.Protein marker;1.Total protein before IPTG induction;2.Total protein after IPTG induction;3.Supernatant after ultrasonication;4.Precipitation after ultrasonication

融合蛋白親和層析后的SDS-PAGE如圖4所示，經透析去除尿素后，絕大多數目的蛋白變為可溶形式，透析后袋內液的上清用Ni-IDA親和層析純化過程簡單、高效，獲得了高濃度的融合蛋白(圖4泳道5)，且純化后的樣品純度也可達到85%左右，達到了進行DNA-蛋白質結合實驗的純度標準。

3 討 論

sp1是一種在體內各種組織中廣泛表達的轉錄因子，其C端區域含有3個連續的鋅指結構域為DNA的識別與結合結構域，這些鋅指結構域能夠特異性地識別并結合靶基因啟動子區域GC-rich的位點，從而對基因的轉錄進行調控。研究發現，sp1參與調控多種重要的組成型基因［7，14］，在維持機體正常發育及生命活動的過程中起重要作用，同時其作為體內廣泛表達并發揮作用的轉錄因子，機體對sp1的表達水平也有嚴格的調控［15-17］。通常情況下，受sp1調控的下游基因多為細胞增殖、細胞分化、細胞生長以及促進腫瘤的侵襲與遷移等相關的基因。sp1作為轉錄因子，自身表達水平的上調或下調能夠激活或者抑制這些基因的表達，從而調控腫瘤的發生、生長、轉移以及血管生成等過程，在腫瘤的發生過程中扮演了非常重要的角色。而且，它在許多惡性腫瘤中表達明顯升高，與腫瘤的惡化及轉移程度相關［18］。因此，了解sp1的調控機制，不但有助于了解腫瘤的發生機制，還可為治療提供潛在的靶點。

在本研究中，我們使用了大腸桿菌的原核表達系統，經過一系列條件的探索，尋找到一種能夠快速、高效地表達并且純化出人轉錄因子sp1蛋白的方法，為

圖4 融合蛋白親和層析后SDS-PAGEFig 4 SDS-PAGE after affinity chromatography of fusion protein M.Protein marker;1.Sample of the affinity chromatography;2.Liquid that flows though;3.Eluate of other protein;4-7.Eluate of target protein(the elution peak is lane 5)

其下游靶基因的調控研究奠定了基礎。

［1］EMERSON R O，THOMASJ H.Adaptive evolution in zinc finger transcription factors［J］.PLoSGenetics，2009，5(1):e1000325.

［2］VAQUERIZASJM，KUMMERFIELD SK，TEICHMANN SA，et al.A census of human transcription factors:function，expression and evolution［J］.Nat Rev Genet，2009，10:252-263.

［3］WIERSTRA I.Sp1:emerging roles-beyond constitutive activation of TATA-less housekeeping genes［J］.Biochemi Biophys Res Commun，2008，372:1-13.

［4］KADONAGA JT，CARNER K R，MASIARZ F R，et al.Isolation of cDNA encoding transcription factor sp1 and functional analysis of the DNA binding domain［J］.Cell，1987，51:1079-1090.

［5］DYNAN W S，TJIAN R.Isolation of transcription factors that discriminate between different promoters recognized by RNA polymeraseⅡ［J］.Cell，1983，32:669-680.

［6］LI L，HE SH，SUN JM.Gene regulation by sp1 and sp3［J］.Biochemistry Cell Biology，2004，82(4):460-471.

［7］BOUWMAN P，PHILPSEN S.Regulation of the activity of sp1-related transcription factors［J］.Mol Cell Endocrinol，2002，195:27-38.

［8］KAMADA M，SO A，MURAMAKI M，et al.Hsp27 knockdown using nucleotide-based therapies inhibit tumor growth and enhance chemotherapy in human bladder cancer cells［J］.Cancer Ther，2007，6(1):299-308.

［9］JENNINGSR，ALSARRAJ M，WRIGHT K L，et al.Regulation of the human transforming growth factor beta typeⅡreceptor gene promoter by novel sp1 sites［J］.Oncogene，2001，20(47):6899-6909.

［10］AMMANAMANCHI S，BRATTAIN M G.Sp3 is a transcriptional repressor of transforming growth factor-beta receptors［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3348-3352.

［11］張俊，計駿，袁菲，等.轉錄因子sp1在胃癌中的表達及其與預后的關系［J］.中華腫瘤雜志，2005，9:531-533.

［12］SAFE S，ABDELRAHIM M.Sp transcription factor family and its role in cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41(16):2438-2448.

［13］LOU Z，O'REILLY S，LIANG H，et al.Down-regulation of over-expressed sp1 protein in human fibro sarcoma cell lines inhibits tumor formation［J］.Cancer Res，2005，65(3):1007-1017.

［14］ZAID A，LI R，LUCIAKOVA K，et al.On the role of the general transcription factor sp1 in the activation and repression of diverse mammalian oxidative phosphorylation genes［J］.J Bioenerg Biomembr，1999，31(2):129-135.

［15］OH J E，HAN J A，HWANG E S.Down-regulation of transcription factor，sp1，during cellular senescence［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，353:86-91.

［16］IHN H，IHN Y，TROJANOWSKA M.Sp1 phosphorylation induced by serum stimulates the human alpha2(Ⅰ)collagen gene expression［J］.J Invest Dermatol，2001，117(2):301-308.

［17］YOU H L，ENG H L，HSU S F，et al.A PKC-Sp1 signaling pathway induces early differentiation of human keratinocytes through up-regulation of TSGIO1［J］.Cell Signal，2007，19:1201-1211.

［18］LUDIWIG H，KHAYAT D，GIACCONE G，et al.Proteasome inhibition and its clinical prospects in the treatment of hematologic and solid malignancies［J］.Cancer，2005，104(9):1794-1807.