白花丹參不同炮制品水提物抗小鼠心肌缺血缺氧的作用

王 浩 李玉琴 高永峰 辛曉明 徐曉燕 高允生 (泰山醫學院藥學院，山東 泰安 271016)

丹參是常用的活血化淤中藥。白花丹參為唇形科植物丹參的白花變型，以根入藥，是山東道地藥材之一，屬瀕危珍稀藥用植物。多年來，人們對紫花丹參研究較多，而對于白花丹參的研究仍處于起步階段〔1〕。臨床上丹參以生品和炮制品入藥〔2〕。丹參炮制入藥自唐代就有“熬令紫色”;宋代有炒炙、焙制;明清代有酒洗、酒浸、酒炒、酒蒸、豬血拌炒。目前丹參的炮制方法主要有酒炙、炒炭、麩炒、豬血制、醋制等〔3〕。隨著炮制方法不同，其化學成分也發生了變化。生丹參主治溫熱病熱入營血，所致心肌怔仲、失眠等癥，如《溫病條辨》清營湯。制丹參主要用于氣滯血瘀、心胃諸痛等，如《時方歌括》丹參飲;胸憋悶、心絞痛，如《中國藥典》(2005)復方丹參片〔4〕;氣滯血瘀、胸悶、心悸氣短，如《中國藥典》(2005)冠心丹參片〔4〕。目前對于白花丹參是否具有抗心肌缺血作用，不同的炮制方法是否對這個作用存在影響還鮮見報道。因此，本研究采用不同的方法炮制白花丹參，并提取其中的水溶性成分，通過多種模型觀察其對小鼠心肌缺血缺氧的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 白花丹參原藥由泰山醫學院藥學院藥材栽培基地種植，于秋季取樣，經藥物分析教研室李玉琴博士鑒定。取原藥去雜質及莖葉，取其根切片進行酒炙與炒炭。酒炙白花丹參:取丹參片，加入定量黃酒拌勻，稍悶潤，待酒被吸盡后，置炒制容器用文火加熱，炒干，取出晾涼，粉碎，過二十目篩;炒炭白花丹參:取丹參片，置炒制容器內，用武火加熱，炒至表面焦黑色，內部焦褐色，取出晾涼，粉碎，過二十目篩。取酒炙白花丹參、炒炭白花丹參及生品白花丹參加入蒸餾水煎煮3次(W/V=1∶5)，每次武火煮沸后，文火微沸30 min，合并濾液，旋轉蒸發儀濃縮適當濃度備用。異丙腎上腺素購于上海禾豐制藥有限公司。垂體后葉素注射液購于蚌埠市宏業生化制藥廠;復方丹參片購于山東仙河藥業有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號:20100317)。

1.2 白花丹參生品、酒制品及炒炭品中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和丹酚酸A的含量測定 根據文獻〔5〕所述的方法，測定了白花丹參3種炮制品種4種水溶性成分的含量，測定結果見表1。

表1 白花丹參3種炮制品中四種水溶性成分的含量(s)

表1 白花丹參3種炮制品中四種水溶性成分的含量(s)

炮制品 丹參素(mg/g)原兒茶醛(mg/g)丹酚酸B(mg/g)丹酚酸A(mg/g)

1.3 實驗儀器 小動物耐低氧與耗氧量動態變化同步測定裝置〔6〕(泰山醫學院藥學院制備，專利號CN2698274);BL-410生物機能實驗系統(成都泰盟生物科技有限公司);紫外分光光度計(上海棱光技術有限公司)。

1.4 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，購于泰山醫學院實驗動物中心，合格證號:魯動質字020103。

1.5 實驗分組及方法

1.5.1 白花丹參不同炮制品水提物對異丙腎上腺素致心肌缺氧小鼠存活時間的影響 取小鼠隨機分為9組，各10只，即空白組、模型組、復方丹參片組(3.6 g·kg-1·d-1)、生品白花丹參水提物高、低劑量組，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組，炒炭白花丹參水提物高、低劑量組，劑量分別為30、20 g/kg。各給藥組灌胃相應劑量藥物，而空白組及模型組灌胃等容量蒸餾水，1次/d，連續5 d。末次給藥1 h后，除空白組皮下注射等容量生理鹽水外，余組皮下注射異丙腎上腺素20 mg/kg，15 min后將小鼠放入裝有鈉石灰的小動物耐低氧與耗氧量動態變化同步測定裝置中，密閉裝置，記錄小鼠存活時間。

1.5.2 白花丹參不同炮制品水提物對夾閉氣管小鼠心電維持時間的影響 取小鼠隨機分為8組，各8只，即空白組，復方丹參片組(3.6 g/kg)、藥物干預分組及給藥劑量同上。除空白組灌胃等容量蒸餾水，余組給予相應劑量藥物，1次/d，連續5 d。末次給藥1 h后皮下注射烏拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物機能實驗系統描記小鼠標Ⅱ導聯心電圖，記錄一段正常心電圖后，動脈夾夾閉氣管，記錄小鼠心電維持時間(s)。

1.5.3 酒炙白花丹參水提物對垂體后葉素誘導小鼠心肌缺血的影響 小鼠于實驗前進行篩選，剔除心電圖(ECG)異常者。取ECG正常小鼠分為5組各10只，即對照組、模型組、酒炙白花丹參水提物高、低劑量組(30 g/kg、20 mg/kg)，復方丹參片組(3.6 g/kg)，空白組及模型組給予等容量蒸餾水，1次/d，連續2 w。末次給藥1 h后皮下注射烏拉坦(1.3 g/kg)麻醉、固定，BL-410生物機能實驗系統描記小鼠標準Ⅱ導聯心電圖，除空白組小鼠尾靜脈注射等容量的生理鹽水外，余組尾靜脈注射垂體后葉素(30 U/kg)。連續記錄給藥后 10、30 s、1、2、5、10、20、30 min時ECG，以PR段為基線記錄各組小鼠J點位移絕對值(mV)及心率的變化，每個時間點測3個連續的波型，取其平均值。給予垂體后葉素30 min后，各組小鼠摘眼球取血，按試劑盒說明測定血清LDH、CK的活性。取心臟制成組織勻漿，取上清液，參照試劑盒說明書測定心肌組織MDA、NO含量及SOD活力，考馬斯亮藍測定組織中蛋白含量。

2 結果

2.1 白花丹參不同炮制品水提物對異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活時間及夾閉氣管小鼠心電維持時間的影響 與空白組相比，模型組小鼠缺氧存活時間明顯縮短(P＜0.01)。而生品低劑量組，酒炙高、低劑量組能明顯延長小鼠缺氧存活時間(P＜0.05)，提高小鼠15 min和20 min的存活率，且生品低劑量組、酒炙高劑量組作用優于復方丹參片組。與空白組相比〔(367.13±59.24)s〕，生品高劑量組、酒炙低、高劑量組、炒炭低劑量組和復方丹參片組能明顯延長夾閉氣管小鼠心電維持時間 〔(759.17 ± 250.57)s，(651.29 ± 241.35)s，(672.43±105.90)s，(596.00±160.53)s，(717.50±263.75)s，P＜0.05〕，生品低劑量組、炒炭高劑量組小鼠心電維持時間無明顯改變〔(553.4±99.28)s、(417.25±156.58)s，P＞0.05〕。見表 2。

表2 白花丹參不同炮制品水提物對異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活時間(s)的影響

表2 白花丹參不同炮制品水提物對異丙腎上腺素致缺氧小鼠存活率〔n(%)〕及存活時間(s)的影響

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 n 15 min 20 min 存活時間(min)空白組 10 10(100.00)9(90.00)23.10±2.693)模型組 10 4(40.00)0(0.00)15.00±1.60生品低劑量組 9 6(66.67)3(33.33)19.50±1.391)生品高劑量組 8 5(62.50)0(0.00)17.00±1.41酒炙低劑量組 10 9(90.00)2(20.00)18.25±4.892)酒炙高劑量組 10 9(90.00)4(40.00)19.12±3.231)炒炭低劑量組 9 6(66.60)0(0.00)14.56±1.59炒炭高劑量組 8 6(75.00)1(12.50)17.25±5.63復方丹參片組 10 9(90.00)1(10.00)18.19±2.072)

2.2 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心電圖的影響 與空白組相比，模型組小鼠藥后30 s心率明顯減慢(P＜0.01)，10 min后恢復;而藥后10 s即可引起J點明顯上抬、位移絕對值提高(＞0.1 mV)(P＜0.01)，5 min 后恢復，說明垂體后葉素能引起心肌缺血。酒炙白花丹參水提物高、低劑量組及復方丹參片組均能顯著對抗垂體后葉素所致的心率減慢及J點的改變(P＜0.05)。結果見表 3、表4。

表3 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心率的影響(n=10，s)

表3 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心率的影響(n=10，s)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05

組別 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白組 523.57±70.81 517.00±64.58 535.00±63.13 536.50 ± 88.75 540.50±84.60 534.66±80.70 510.33±77.44 489.16±82.17模型組 466.71±91.66 277.00±155.471)323.38±81.231)364.50±100.831)409.50±118.702)491.00±154.87 530.13±125.23 562.63±35.97酒炙低劑量組 518.00±105.93 427.17±113.214)479.14±106.994)506.17±114.154)553.50±87.374) 520.83±78.32 505.14±63.58 515.00±62.93酒炙高劑量組 502.57±153.04 432.00±60.744)508.67±102.933)513.00±109.813)550.57±99.974) 531.71±85.65 520.32±92.62 516.83±107.35復方丹參片組 478.00±78.59 463.33±47.303) 490.17±78.544)496.50±108.874)507.33±91.174) 511.00±82.51 510.67±74.48 500.66±82.33

表4 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心電圖J點位移絕對值的影響(n=10，s)

表4 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心電圖J點位移絕對值的影響(n=10，s)

與空白組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 10 s 30 s 1 min 2 min 5 min 10 min 20 min 30 min空白組 0.020 8±0.010 4 0.023 3±0.007 6 0.030 8±0.006 2 0.024 5±0.011 7 0.048 5±0.017 7 0.023 8±0.009 7 0.061 5±0.020 8 0.063 3±0.017 9模型組 0.329 6±0.052 81)0.153 1±0.021 51)0.117 1±0.029 61)0.069 5±0.020 5 0.035 0±0.011 3 0.033 9±0.011 8 0.066 5±0.015 3 0.052 5±0.019 1酒炙低劑量組 0.290 5±0.034 7 0.114 8±0.034 3 0.076 7±0.020 63)0.047 5±0.034 0 0.045 2±0.014 0 0.017 4±0.007 1 0.066 8±0.012 3 0.051 2±0.026 5酒炙高劑量組 0.201 1±0.020 02)0.090 4±0.024 42)0.068 0±0.029 72)0.057 2±0.038 0 0.498 6±0.024 8 0.031 3±0.011 8 0.050 8±0.014 7 0.048 5±0.015 6復方丹參片組 0.231 1±0.033 93)0.103 5±0.020 43)0.078 7±0.021 23)0.055 0±0.015 9 0.056 3±0.014 8 0.043 1±0.017 6 0.044 8±0.020 2 0.054 8±0.033 0

2.3 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠血清生化指標的影響 與空白組相比，模型組小鼠血清LDH和CK活性顯著升高(P＜0.01)。與模型組相比，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組LDH 活性明顯降低(P＜0.05、0.01)，僅高劑量組能明顯降低CK 活性(P＜0.01)。見表5。

2.4 酒炙白花丹參對心肌缺血小鼠心肌組織生化指標的影響

與空白組相比，模型組小鼠心肌組織中MDA含量升高，SOD活力及 NO 含量均明顯下降(P＜0.05、P＜0.01)。與模型組相比，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組MDA水平顯著降低，SOD活力及 NO 含量明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表6。

表5 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影響(s，n=10)

表5 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠血清LDH和CK活性的影響(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05

組別 LDH(U/L)CK(U/ml)空白組 5 899.30±537.91 0.99±0.48模型組 8 933.98±1955.081) 3.20±0.851)酒炙低劑量組 7 356.06±1049.332) 2.58±0.83酒炙高劑量組 7 236.11±753.363) 1.85±0.582)復方丹參片組 6 602.81±729.712) 1.79±0.602)

表6 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心肌組織中SOD活性和MDA、NO水平的影響(s，n=10)

表6 酒炙白花丹參水提物對心肌缺血小鼠心肌組織中SOD活性和MDA、NO水平的影響(s，n=10)

與空白組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

組別MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)NO(μmol/mgprot)空白組 34.43±13.63 184.62±41.44 0.19±0.07模型組 61.67±15.991) 123.47±17.981) 0.10±0.012)酒炙低劑量組 45.43±14.512) 168.39±35.712) 0.21±0.103)酒炙高劑量組 35.02±6.543) 176.25±41.882) 0.13±0.01復方丹參片組 38.63±17.043) 189.65±40.423) 0.20±0.073)

3 討論

缺氧是一種緊張性刺激，可引起機體產生各種應激性反應，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化供能，最終導致機體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡〔7，8〕。異丙腎上腺素皮下注射可造成心肌細胞缺血缺氧損傷，是一種常用的動物實驗性心肌缺血模型。本研究結果顯示，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組均可明顯延長小鼠耐缺氧存活時間，明顯提高15、20 min小鼠的存活率，雖生品白花丹參水提物低劑量組也可延長小鼠存活時間，但對于小鼠存活率的影響不如酒炙白花丹參水提物明顯。對于夾閉氣管小鼠心電維持時間的影響，酒炙白花丹參水提物高、低劑量組均具有延長作用，生品高劑量組及炒炭低劑量組白花丹參水提物也可延長小鼠心電維持時間，但與酒炙白花丹參低劑量組無差異。綜合以上，本課題組又進一步對酒炙白花丹參水提物的抗心肌缺血作用進行了研究。推測出現此結果的可能原因，與經不同的方法炮制后提取物的成分及含量不同有關。本課題組對3個炮制品水溶性分丹參素、丹酚酸B、丹酚酸A、原兒茶醛進行了檢測，結果顯示酒炙白花丹參水提物中包含丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B 3種成分，尤其丹酚酸B含量較高。丹酚酸B能夠增加冠脈流量，還具有纖溶、保護血管內皮、抗氧化作用丹參素、原兒茶醛，是丹參中發揮抗心肌缺血作用的主要成分。有研究發現〔9〕，丹酚酸B的抗氧化作用明顯強于丹參素及原兒茶醛。但對于進一步機制還有待研究。

垂體后葉素可引起冠狀動脈痙攣，造成急性心肌供血不足，同時收縮全身小血管，增加外周阻力進而增加心臟后負荷，因此注射垂體后葉素可致動物發生急性心肌缺血，是常用的心肌缺血模型之一。ECG J點及心率是判斷心肌缺血發生與否的一個重要指標〔10〕。本實驗結果顯示，尾靜脈注射垂體后葉素后，J點位移增高、心率減慢，提示發生心肌缺血。而酒炙白花丹參低、高劑量對急性心肌缺血ECG J點及心率的改變有明顯的改善作用，提示該藥物對缺血心肌具有明確的保護作用，能夠改善心肌供血供氧，維護心功能。缺血性心肌酶的釋放量是心肌損害程度的主要標志，也是判斷細胞從可逆到不可逆損傷的重要標志。心肌細胞的缺血缺氧使細胞膜的完整性受損，膜通透性增加，引起心肌酶釋放增多，使血清中酶活力升高 ，造成心肌細胞代謝紊亂〔11〕。本實驗結果表明，酒炙白花丹參可減輕細胞膜的損傷程度，減少心肌酶的釋放，保護心肌細胞。NO是血管內皮細胞利用L-精氨酸在NOS作用下合成的具有擴張血管作用的內源性物質，被認為是內源性的心臟保護物質〔12〕。本實驗觀察到酒炙白花丹參水提物可顯著抑制心肌缺血后NO含量的降低，提示其抗心肌缺血作用可能與NO有關。

總之，白花丹參不同炮制品水提物均有不同程度的耐缺氧作用，其中酒炙白花丹參水提物效果較好，進一步研究發現，酒炙白花丹參水提物具有明顯的抗心肌缺血作用，可能與其具有抗氧化、影響NO有關。

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