重組白細胞介素12抑制哮喘小鼠肺部炎癥的機制

王紅陽 王 袁 王宏麗 郝小惠 劉和亮， (河北聯合大學附屬醫院呼吸內科，河北 唐山 063000)

支氣管哮喘是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。它是呼吸系統的常見病和多發病，但其發病機制至今尚不十分清楚〔1〕。現有的藥物并不能徹底治療哮喘，因此世界衛生組織把哮喘確定為終身治療性疾病〔2〕。隨著細胞生物學和分子生物學技術的不斷進展，人們發現許多與氣道炎癥有關的細胞因子都參與了哮喘的病理生理過程，其中IL-12扮演了極為重要的角色，但它在哮喘免疫治療過程中發揮作用的具體機制還不清楚。本研究旨在觀察IL-12對哮喘小鼠體內腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-10、一氧化氮(NO)和IgE水平的影響，探討其治療哮喘的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級6～8周齡的C57BL/6雄性小鼠45只，平均體重18～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號:CSXK京2009-0004。

1.2 主要試劑與儀器 OVA(A5503，美國 Sigma公司)，氫氧化鋁(天津市大茂化學試劑廠)，rmIL-12(210-12，美國PEROTECH EC公司)，小鼠 TNF-α、IL-10、NO 和 IgE ELISA 試劑盒(美國R＆B公司);402AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司);自制透明霧化吸入箱(30 cm×20 cm×10 cm);酶標儀(瑞士帝肯公司);低溫高速離心機(3K30，美國 Sigma公司);電熱恒溫培養箱(DNP-9052，上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3 實驗動物的分組 正常飼養7 d，使小鼠適應環境后，采用隨機數字表法將45只小鼠隨機分成3組，即rmIL-12組20只，哮喘組20只，對照組5只。前兩組又各自分為末次激發后1 d，2 d，4 d，8 d 四個亞組(每個亞組:n=5)。

1.4 小鼠模型的建立 參照文獻〔3〕方法建立哮喘小鼠模型。哮喘組和 rmIL-12組小鼠分別于第 0、7和 14天腹腔注射0.2 ml OVA致敏液(含OVA 20 μg和氫氧化鋁2 mg的PBS溶液)進行致敏，第21～27天將兩組小鼠依次置于一自制透明的不完全密閉的有機玻璃盒內 (容積為30 cm×20 cm×10 cm)，以1%OVA溶液20 ml(含0.2 g OVA的PBS溶液 )進行霧化激發，每天一次，每次30 min，連續7 d。rmIL-12組在哮喘組的基礎上，每次激發前30 min，每只小鼠腹腔注射0.1 ml含0.14 μg rmIL-12的PBS溶液進行治療。對照組用等量的PBS溶液進行致敏和激發。在實驗過程中，密切觀察各組小鼠的一般情況，包括進食，活動、呼吸、體重、精神狀態以及抓撓顏面部等過敏行為的變化，并做相應的記錄。

1.5 標本采集和處理 對照組小鼠在末次激發后2 d處死，哮喘組和 rmIL-12組小鼠在末次激發后1、2、4、8 d分四個時間段處死。所有小鼠通過彎鑷摘取一側眼球的方式進行采血，離心后的血漿-70℃儲存待測NO和IgE水平。然后仰臥位固定小鼠，打開胸腔，結扎右肺下葉待做病理。剪開小鼠頸部皮膚，暴露頸前氣管，在環狀軟骨上方做一橫行切口，給兩側支氣管肺泡同時進行灌洗。每次緩慢注入PBS 1 ml，重復操作3次，3次獲得的BALF混勻后離心，收集其上清液，-70℃冰箱儲存用于檢測IL-10、TNF-α含量。細胞沉淀用于細胞總數和嗜酸性粒細胞(EOS)分類計數。最后剪下結扎的右肺下葉用于HE染色觀察炎癥反應情況。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析。首先對所得數據進行正態性和方差齊性檢驗，各組數據均符合正態分布，數據以s表示。組間比較采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)。

2 結果

2.1 各組小鼠在激發過程中的一般情況 致敏階段:各組小鼠在進食、活動、精神狀態、呼吸、體重、大小便等方面均未見明顯的異常和組間差別。激發階段:對照組小鼠激發前后上述指標無明顯異常。哮喘組小鼠激發后的精神狀態較致敏階段差，食欲下降，體重減輕。激發過程中，在霧化吸入OVA 5 min左右后呼吸便加深加快，甚至出現點頭呼吸，頻繁搔抓顏面皮毛，前肢縮抬，縮頭弓背等哮喘急性發作表現，繼而小鼠俯伏不動。與哮喘組相比，rmIL-12組小鼠上述哮喘癥狀明顯減輕。

2.2 各組小鼠BALF中細胞總數和EOS百分比的動態變化哮喘組小鼠的細胞總數在第1天達高峰，EOS百分比在第2天達高峰。rmIL-12組小鼠的細胞總數和 EOS百分比在1、2和4 d隨時間延長其水平逐漸降低，但至第8天時都略有回升。與相同時間段的哮喘組相比，rmIL-12組的細胞總數，EOS百分比明顯降低，在末次激發后1、2和4 d差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組小鼠BALF中細胞總數和EOS百分比的動態變化(s，n=5)

表1 各組小鼠BALF中細胞總數和EOS百分比的動態變化(s，n=5)

與對照組比較:1)P＜0.05;與哮喘組比較:2)P＜0.05，下表同

組別 細胞總數(×104/ml)EOS百分比(%)對照組 19.47±1.87 0.05±0.04哮喘組 1 d 115.84±7.15 11.90±1.38 2 d 106.12±9.791) 32.57±3.981)4 d 58.15±9.57 9.94±1.03 8 d 35.86±1.98 6.42±0.69治療組 1 d 47.74±3.582) 7.19±0.762)2 d 29.54±3.992) 2.33±0.492)4 d 26.19±4.052) 0.45±0.202)8 d 31.52±3.85 5.42±0.59

2.3 各組小鼠TNF-α、IL-10、NO和 IgE水平的動態變化 哮喘組小鼠的TNF-α、NO、IgE在第2天達高峰，以后逐日下降，至第8 d時仍然高于對照組水平，IL-10隨時間延長其水平逐漸降低，后者至第8天時略有回升，出現釋放高峰的延遲。rmIL-12組與相同時段的哮喘組相比，TNF-α、NO、IgE水平明顯降低，IL-10水平明顯升高，TNF-α和NO在1、2，4 d和8 d差異均具有統計學意義(P＜0.05)，IL-10在1、4和8 d具有統計學意義(P＜ 0.05)，IgE 在2 d和4 d具有統計學意義(P＜ 0.05)。見表2。

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-10及血漿NO、IgE水平動態變化(s，n=5)

表2 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-10及血漿NO、IgE水平動態變化(s，n=5)

組別 BALF(pg/ml)TNF-α IL-10血漿(μg/ml)NO IgE對照組 196.07±14.39 206.01±6.29 9.41±0.61 3.41±0.26哮喘組1 d 324.29±9.20 171.10±3.30 20.31±0.80 6.04±0.28 2 d 394.32±12.631)149.20±4.961)25.16±0.721)7.28±0.291)4 d 340.76±10.32 123.27±5.41 22.05±0.62 5.99±0.18 8 d 270.86±11.90 120.24±3.70 20.45±0.72 4.98±0.23治療組1 d 302.92±6.002)121.34±4.832)17.74±0.572) 5.78±0.23 2 d 268.19±9.702)152.41±3.63 13.71±0.662)5.45±0.172)4 d 249.50±6.982)153.78±5.122)13.35±1.162)5.22±0.152)8 d 247.00±8.122)156.09±4.582)12.85±1.002) 4.95±0.19

2.4 肺組織病理改變 對照組小鼠的肺泡和中小細支氣管結構正常:肺泡上皮細胞排列規整，支氣管管腔和肺泡腔內無異物，管壁和平滑肌厚度正常。血管、氣道周圍未見明顯的炎性細胞浸潤。哮喘組小鼠的肺泡腔內充滿滲出液，肺泡間隔變寬。支氣管的管壁杯狀細胞增生，管壁增厚，管腔縮小且不規則，可見黏液栓。支氣管管壁、血管周圍和肺間質內有大量炎性細胞浸潤，主要是嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和漿細胞等。rmIL-12組與哮喘組相比，小鼠的支氣管黏膜上皮和肌層均完好，細支氣管無明顯痙攣、收縮，管腔較為規則。肺泡管和肺泡壁結構受損程度明顯輕于哮喘組，支氣管管腔及肺泡腔中黏液栓明顯減少。肺組織及血管周圍炎性細胞浸潤程度明顯減輕。見圖1。

圖1 小鼠肺組織病理結果(HE，×100)

3 討論

哮喘是呼吸系統的常見病和多發病，其發病機制迄今仍未完全闡明。目前公認的是哮喘的反復發作是由于炎癥介質、炎性細胞之間相互調控，相互制約的失常，從而導致炎癥-上皮細胞損傷-氣道重構的惡性循環〔4～6〕。因此，炎性介質的研究對闡明哮喘的發病機制具有極為重要的意義。IL-12是細胞免疫中一類重要的調節因子，它屬于Th1型細胞因子，主要介導細胞免疫過程〔7，8〕。IL-12幾乎完全由活化的抗原提呈細胞(包括樹突狀細胞，單核/巨噬細胞和B淋巴細胞)分泌〔9〕，它具有多種生物學功能在哮喘發病過程中具有保護作用:①在體外可以通過干擾素依賴機制和干擾素非依賴機制抑制B細胞合成IgE，從而調節Th1/Th2細胞介導的免疫應答平衡;②轉變B細胞產生抗體的類型，降低 IgG1水平，提升 IgG2a，IgG2b，IgG3水平〔10〕;③抑制嗜酸性粒細胞向氣道內浸潤，抑制肥大細胞和嗜堿性粒細胞合成Th2型細胞因子，同時抑制其脫顆粒反應;④和局部產生的IFN-γ協同作用，共同降低過敏原導致的氣道高反應性。IL-10是近年來發現的具有抗炎作用的細胞因子。它幾乎能夠抑制所有促炎因子的合成與釋放，包括一些在哮喘發病過程中過度表達的細胞因子(如 TNF-α、IL-4、IL-5等)〔11〕。它還能通過抑制嗜酸粒細胞表達CD40從而發揮抗過敏效應。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的一種具有廣泛生物學活性的多肽類細胞因子。它可引起支氣管的高反應性〔12〕。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化左旋精氨酸(L-精氨酸)與氧分子而成。在某些病理條件下，NO的大量釋放會產生細胞毒作用，損壞組織細胞，擴張支氣管黏膜血管，增強毛細血管的滲出及炎癥介質的釋放〔13，14〕。除此之外，NO還能夠促進嗜酸性粒細胞的趨化，并抑制其凋亡〔15〕，因而是哮喘的危險因素。IgE是由B細胞合成的一種可介導Ⅰ型變態反應的免疫球蛋白，血清總IgE水平的增高和氣道內嗜酸性粒細胞浸潤分別是支氣管哮喘的主要免疫學特征和病理學特征。因此，由上可以得知IL-10、IL-12是哮喘發生時的保護因子，TNF-α，NO是哮喘的危險因子。

本研究結果顯示，IL-12對哮喘小鼠氣道炎癥有良好的治療作用。IL-12正是通過抑制炎癥介質TNF-α、NO的釋放同時促進抑炎因子IL-10的合成從而使炎癥反應與抗炎反應重新回復平衡。同時各類研究也表明IL-12在治療哮喘方面有相當不錯的研究前景。國內學者用能產生活性IL-12的乳球菌滴鼻治療哮喘小鼠，發現Th2型細胞因子的合成明顯受到抑制，氣道高反應性和肺內炎癥明顯減輕，局部細胞免疫功能低下的狀態明顯改善〔16〕。Li等〔17〕發現在卵白蛋白激發時肌內注射rm IL-12可減輕杯狀細胞的增生，抑制黏液的分泌。

綜上所述，白細胞總數、EOS百分比、TNF-α、IL-10、NO 和IgE水平綜合的動態變化可作為反映支氣管哮喘氣道炎癥的重要指標，以IL-12為靶點的治療方案也為臨床上哮喘的治療帶來了新希望，有望成為治療哮喘的新途徑。

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