頭孢曲松鈉對腦缺血再灌注模型大鼠的腦保護作用

顏志婷 熊建忠 林小小 黃樂松 (萍鄉市人民醫院藥劑科，江西 萍鄉 337055)

興奮性氨基酸的毒性作用在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。谷氨酸是腦內必需的興奮性神經遞質之一，興奮性氨基酸轉運體2是最主要的谷氨酸轉運體，負責腦內90%以上的谷氨酸再攝取，調節突觸間隙的谷氨酸濃度，在多種神經退行性疾病的發病過程中起重要作用。文獻表明〔1，2〕，多種β-內酰胺類抗生素如頭孢曲松鈉等是興奮性氨基酸轉運體2的轉錄激活劑，可以增加興奮性氨基酸轉運體2的蛋白表達水平，產生神經保護作用。本研究探討頭孢曲松鈉預處理對缺血性損傷腦保護的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 腫瘤壞死因子(TNF)-α的PCR引物(上海生物工程技術有限公司合成)。頭孢曲松鈉(臺灣泛生制藥廠股份有限公司提供，批號:1010050);2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色劑(TTC，青島高科園海博生物技術有限公司提供)。

1.2 實驗分組 雄性SD大鼠36只，體重250～300g，隨機分為3組:(1)假手術組(大鼠于手術前5 d開始注射頭孢曲松鈉，連續5 d，每天1次)。(2)生理鹽水(手術前5 d開始注射等量的生理鹽水，連續5 d)。(3)頭孢曲松鈉(手術前5 d開始注射頭孢曲松鈉，連續5 d)。

1.3 腦缺血再灌注模型的制作 以Longa改良法制備大鼠缺血再灌注模型。麻醉，頸部正中切口，在大鼠頸總動脈分叉處剪一小口，沿頸內動脈向顱內插入魚線(18.5±1.5)mm，栓塞90 min后將魚線拔出。假手術組魚線插入深度為10 cm，其余步驟同Longa改良法。

1.4 取材和HE染色 大鼠缺血再灌注24 h后，麻醉。生理鹽水和4%多聚甲醛PBS液進行心臟灌注。斷頭取腦組織塊，固定，脫水，包埋，連續切片。常規HE染色。光鏡觀察，攝片。

1.5 TTC染色與腦缺血體積的測定 在缺血再灌注48 h后，每組取6只大鼠10%水合氯醛深度麻醉，快速斷頭取腦。將鼠腦立即置于-20℃冰箱中10 min后取出，行2 mm厚連續冠狀切片，共5片。將切片立即置于2%TTC溶液中，37℃恒溫下避光染色30 min，然后置于4℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24 h。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。分離蒼白區 (梗死區)和非蒼白區(正常區)，梗死百分比(%)=蒼白區重量/(蒼白區重量 +非蒼白區重量 )×100%〔3〕。

1.6 大鼠神經功能缺損評分 參照Bederson等確立的5級評分法對大鼠的神經功能缺損進行評分，分值越高，動物行為障礙越嚴重。0分:大鼠無神經損傷癥狀。1分:大鼠不能完全伸展對側前爪。2分:大鼠向對側轉圈。3分:大鼠向對側傾倒。4分:大鼠不能自發行走，意識喪失。

1.7 TNF-α mRNA檢測 大鼠缺血再灌注48 h后斷頭取腦，取腦組織，迅速用液氮冷凍，并放置于-70℃保存。RNA提取采用異硫酸胍法。TNF-α上游引物:5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇，下游引物:5＇CCGTGATGTCTAAGTACTTGG3＇;GAPDH 上游引物 5＇AGTTCAACGGCACAGTCAAGG3＇，下游引物 5＇CTCAAAACTCGAGTGACAAGC3＇。逆轉錄及cDNA擴增，參照相關文獻進行。反應條件:94℃ 2 min，然后按9℃ 1 min，50℃1 min，72℃ 1 min運行30個循環，最后72℃延伸7 min。取出10 μl PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后照相，利用圖像分析系統對產物條帶進行灰度掃描，TNF-α與內對照GAPDH的灰度比值即為其mRNA表達半定量結果。

1.8 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件。多組間比較采用單因素方差分析。方差齊用Bonferroni法。方差不齊采用Welch法和Dunnett法。

2 結果

2.1 行為學結果 假手術組大鼠神經無神經功能缺損，神經功能評分為0分。生理鹽水組大鼠有明顯神經功能缺失，神經功能評分增高。頭孢曲松鈉組大鼠神經功能評分下降，與生理鹽水組相比，差異有統計學意義。見表1。

2.2 TTC染色結果 假手術組TTTC染色均為紅色，腦組織無缺血灶。生理鹽水組相對腦缺血體積增加。頭孢曲松鈉組相對腦缺血體積下降，與生理鹽水組相比差異顯著。見表1。

2.3 TNF-α mRNA表達 假手術組腦組織中僅有少量TNF-α表達，生理鹽水組腦組織中TNF-α表達明顯增高，灰度值增加，頭孢曲松鈉組腦組織中TNF-α表達減少，灰度值下降，與生理鹽水組相比，差別有統計學意義。見表1，圖1。

2.4 HE染色結果 假手術組大鼠大腦皮質組織形態結構無明顯的變化，細胞膜完整，染色質均一。生理鹽水組可見皮質神經元灶性或片狀壞死，間質及神經元水腫明顯。頭孢曲松鈉組神經元壞死減少，神經元及間質水腫明顯減輕。

表1 各組大鼠神經功能評分，TNF-α mRNA表達，相對腦缺血體積比較(s，n=12)

表1 各組大鼠神經功能評分，TNF-α mRNA表達，相對腦缺血體積比較(s，n=12)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 神經功能評分(mm3)相對腦缺血體積(%)TNF-α 灰度值生理鹽水組 2.413 ±0.525 24.472 ±3.08 0.897±0.029假手術組 02) 02) 0.112±0.0072)頭孢曲松鈉組 1.325 ±0.2431) 16.156±2.6832) 0.421±0.0161)

圖1 TNF-α mRNA的表達

3 討論

缺血性腦血管病是威脅人類生命健康的主要疾病之一，薛敏等〔4〕研究認為，年齡、吸煙、高血壓、糖尿病、心房顫動及高高同型半胱氨酸血癥、抗血小板藥物依從性均為缺血性腦卒中患者復發的危險因素。文獻表明〔5〕，缺血性腦損傷時的腦組織可能產生大量的興奮性氨基酸，其中谷氨酸鹽的釋放占有重要作用。突觸內谷氨酸濃度升高引起的一個效應就是N-甲基-D-天冬氨酸受體的激活。N-甲基-D-天冬氨酸受體是鈣通透性的，能引起廣泛的膜去極化和鈣內流，加劇細胞內Ca2+超載。激活DNA酶、蛋白酶和磷脂酶等，并生成自由基，破壞生物膜，引起遲發性神經元死亡。N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑，在動物實驗中被證實有神經保護作用〔6〕。但是也有臨床研究認為在急性缺血性腦卒中發病6 h內靜脈使用N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑并無益處〔7〕，而且另一種谷氨酸受體拮抗劑加維斯替奈的相關臨床試驗結果亦顯示不佳〔8〕。這可能腦缺血后腦組織內谷氨酸鹽迅速增高，而臨床治療卻在腦梗死后幾小時進行，而此時腦組織內谷氨酸鹽已達到高峰。

頭孢曲松鈉是第三代頭孢類抗生素。有研究發現在大鼠腦缺血前給予頭孢曲松鈉預處理對缺血性腦損傷有一定的腦保護作用。本研究證實，在大鼠腦缺血前給予頭孢曲松鈉預處理能起到緩解缺血后腦損傷的作用。頭孢曲松鈉對缺血后損傷的腦保護作用可能與降低腫瘤壞死因子TNF-α表達有關，它可能抑制膠質產生谷氨酸載體，同時可能促進谷氨酸鹽的轉運〔9〕。另外，頭孢曲松鈉預處理能增加腦缺血后谷氨酸載體的表達〔10〕，加速缺血后突觸內谷氨酸鹽的轉運，從而減少興奮性氨基酸的毒性作用。

1 劉興山，崔 淼，董 雪，等.運用臨床路徑對缺血性腦卒中患者實施健康教育的效果〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(16):3961-2.

2 許保磊，王 蓉.興奮性氨基酸轉運體2在神經退行性變中的作用〔J〕.中國比較醫學雜志，2012;22(10):67-71.

3 Hou ST，MacManus JP.Molecular mechanisms of cerebral ischemia-induced neuronal death〔J〕.Int Rev Cytol，2002;221(1):93-148.

4 薛 敏，張 梅，朱 蕾，等.缺血性腦卒中復發的相關危險因素分析〔J〕.中國基層醫藥，2013;20(14):2081-3.

5 李 軍，曾邦雄.腦缺血性損傷級聯反應的研究進展〔J〕.國外醫學·麻醉學與復蘇分冊，2001;22(6):364-8.

6 李淑蘭，劉鳳蓮，王學斌，等.谷氨酸及其受體在腦內的存在作用與谷氨酸的神經毒性〔J〕.中國臨床康復，2004;8(22):4553-5.

7 徐 恩，繆學瓊，李 雯，等.神經保護藥物治療缺血性腦卒中的最新進展〔J〕.中國處方藥，2006;2:38-41.

8 Sacco RL，DeRosa JT，Haley EC Jr，et al.Glycine antagonist in neuroprotection for patients with acute stroke:GAIN Americas:a randomized controlled trial〔J〕.JAMA，2001;285:1719-28.

9 Pickering M，Cumiskey D，O＇Connor JJ.Actions of TNF-alpha on glutamatergic synaptic transmission in the central nervous system〔J〕.Exp Physiol，2005;90(4):663-70.

10 Chu K，Lee ST，Sinn DI，et al.Pharmacological Induction of Ischemic Tolerance by Glutamate Transporter-1(EAAT2)Upregulation〔J〕.Stroke，2007;38(1):177-82.