高表達Klotho基因對糖尿病大鼠腎臟保護作用的機制

張曉暄 楊曉春 遠 航 程海濤 王 晶 寶 玲 (一汽總醫院腎內科，吉林 長春 300)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病微血管病變，一旦發展到終末期腎衰，往往比其他腎臟疾病治療更加棘手〔1〕。Klotho基因是1997年發現的與衰老發生密切相關的功能性基因〔2〕，在人和大鼠的腎臟高表達，并主要定位于腎小管上皮細胞，在維持正常的腎臟生理功能方面發揮著重要作用。本課題組在前期研究中發現注射Klotho基因的糖尿病腎病模型大鼠，其腎臟病理改變有所好轉，尿微量白蛋白減少，腎功能指標改善，表明Klotho基因對DN具有保護作用，但其機制尚不清楚。本研究擬探討Klotho基因對DN腎臟保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA marker，寶生物工程(大連)有限公司;免疫組化試劑盒、β-actin抗體，Abgent，美國;Klotho抗體、PAI-1抗體，北京博奧森生物技術有限公司;DMEM，Invitrogen，胎牛血清，Hyclon，美國;含Klotho基因的腺病毒，本課題組制備。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康Wistar雄性大鼠72只，購自吉林大學動物中心，體重200～220 g。實驗室適應性喂養1 w后，取18只大鼠為正常對照組(Con組)，其余54只大鼠禁食 12 h，按照 55 mg/kg體重腹腔注射 STZ〔3〕，72 h 后血糖值≥16.67 mmol/L為糖尿病，2 w后檢測大鼠尿微量白蛋白增高證明DN大鼠模型建立成功。Con組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。將54只DN大鼠隨機分為DN組(腹腔注射STZ+靜脈注射等體積生理鹽水)、Ad組(腹腔注射STZ+靜脈注射不含Klotho基因的腺病毒)、Klotho組(腹腔注射STZ+靜脈注射含有Klotho基因的腺病毒)，Con組靜脈注射等體積生理鹽水。從糖尿病模型建立成功后第2周開始，Klotho組尾靜脈注射3×108PFU腺病毒，Ad組尾靜脈注射3×108PFU不含Klotho基因的腺病毒，每2 w注射1次〔4〕，DN組和Con組尾靜脈注射等體積生理鹽水。四組均于第4、8、16周處死大鼠。

1.3 免疫組化檢測Klotho、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI)-1蛋白在糖尿病大鼠腎臟的表達 取糖尿病大鼠腎臟，經4%多聚甲醛固定、切片，2%BSA封閉后，滴加1∶500稀釋的抗大鼠Klotho、PAI-1抗體，DAB顯色。鏡下觀察 Klotho、PAI-1蛋白在腎小球、腎小管及腎間質的表達。以β-actin蛋白作為對照。

1.4 RT-PCR檢測基因mRNA在腎組織的表達情況 取大鼠腎，應用RNA提取試劑盒提取腎臟RNA，RT-PCR擴增Klotho、轉化生長因子(TGF)-β1、p15、p21、p27、PAI-1、β-actin 基因，引物:Klotho 正義:5＇-TGGCTGAACCAAAAAAACAA-3＇，反義:5＇-GAGCGGTCACTAAGCGAATA-3＇，擴增片段 434 bp;TGFβ1 正義:5＇-ATGGTGGACCGCAACAAC-3＇， 反 義:5＇-GAGCACTGAAGCGAAAGC-3＇，擴 增 片 段 328 bp;p15 正 義:5＇-ATCCCAACGCCGTCAACC-3＇，反義:5＇-TGGCCCTGCTCTTCAGCT-3＇，擴增片段 259 bp;p21 正義:5＇-TACGTCTGGGAGCGTGTTC-3＇，反義:5＇-AAATCTGTTAGGCTGGTCTGC-3，擴增片段 266 bp;p27正義:5＇-AGCTTGCCCGAGTTCTACTA-3＇，反義:5＇-CAGGTCGCTTCCTCATCC-3＇，擴增片段 220 bp;PAI-1 正義:5＇-TACGACATCCTGGAACTGC-3＇，反義:5＇-CACCTCGATCTTGACCTTTT-3＇，擴增片段 324 bp;β-actin 正義:5＇-GGCCACCAACTTCGGAGTAA-3＇，反義:5＇-TGTTCCATGACCCCATGAGC-3＇，擴增片段 210 bp。

PCR 反應條件94℃ 30 s，55℃ ～62℃ 30 s，72℃ 20 s，35 個循環，72℃ 7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統照相，Quantity one圖像分析軟件進行灰度分析，以β-actin基因作為對照。

1.5 統計學分析 采用SPSS14.0統計軟件，結果以s表示，兩樣本均數比較用t檢驗。

2 結果

2.1 免疫組化檢測Klotho、PAI-1蛋白在糖尿病大鼠腎臟的表達與分布 與Con組相比，4、8、16 w時，DN組和Ad組大鼠腎小球、腎小管及腎間質內Klotho蛋白表達量減少，而Klotho組大鼠腎臟Klotho蛋白表達量變化不明顯，與Con組接近(圖1);與 Con組相比，DN組和 Ad組 PAI-1蛋白表達量增加，Klotho組的PAI-1蛋白表達量變化不明顯，接近Con組(圖2)。β-actin蛋白在不同時間各組的表達未見明顯改變(圖3)。

2.2 RT-PCR檢測mRNA在腎組織的表達 瓊脂糖凝膠電泳顯示，Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 基因 PCR 產物與預期擴增產物大小一致。與Con組對比，在4、8、16 w時DN組和Ad組的Klotho mRNA表達量明顯減少，Klotho組Klotho mRNA表達量變化不明顯，但高于DN組和Ad組。DN組和Ad組TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1 mRNA 表達量明顯高于 Con 組，Klotho組變化不明顯，接近Con組，但低于DN組和Ad組。見圖 4，圖 5。

圖1 糖尿病大鼠腎臟Klotho蛋白的表達與分布(×200)

圖2 糖尿病大鼠腎臟PAI-1蛋白的表達與分布(×200)

圖3 糖尿病大鼠腎臟β-actin的表達與分布(×200)

圖4 瓊脂糖凝膠電泳顯示各擴增產物條帶

圖5 第 4、8、16 周糖尿病大鼠腎臟 Klotho、TGF-β1、p15、p21、p27、PAI-1基因mRNA的表達

3 討論

ECM進行性積聚是DN的主要病理表現，也是DN進行性發展的重要因素，TGF-β1是DN發生、發展的重要中介，PAI-1是其引起ECM積聚的環節之一。TGF-β1可顯著上調大鼠系膜細胞PAI-1 mRNA和蛋白質的表達并抑制纖溶酶活性〔5〕。DN腎臟PAI-1表達明顯上升，PAI-1通過與組織型纖溶酶原激活物形成復合體而抑制其活性，抑制ECM的降解，對促進DN時ECM 積聚有至關重要的作用〔6～8〕。TGF-β1 既可以直接刺激ECM的合成，又可以通過促進PAI-1等蛋白酶抑制物的表達，促進 ECM 的積聚〔9〕。

Klotho基因是新近發現的獨立的抗衰老基因，通過抑制TGFβ1的信號傳導，可以抑制腎臟纖維化〔10〕。Takeshita等〔11〕研究表明Klotho基因表達下調可能通過上調PAI-1 mRNA的表達參與腎臟纖維化的發生。

腎素-血管緊張素系統(RAS)參與了DN發展的全過程，糖尿病時腎臟局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平增加導致血管收縮、腎小球內壓力增高、腎小球系膜細胞及內皮細胞增生。活性增高的AngⅡ受體通過直接或間接誘導TGF-β1表達，刺激腎臟局部PAI-1的表達，促進腎小管間質成纖維細胞的增殖、分化。與本研究相似，有研究同樣利用腺相關病毒作為載體，將轉染Klotho基因到小鼠體內改善AngⅡ導致的腎臟損傷，轉染組的腎功能改善、蛋白尿減少，腎小管、腎間質病理學改變減輕〔12〕。新近研究發現，在STZ誘導糖尿病小鼠動物模型中，抗衰老Klotho基因的缺失通過加強TGFβ1和mTOR信號表達，加速了早期DN的進展〔13〕。

本研究結果顯示在DN大鼠模型的腎臟中，Klotho基因表達降低，TGF-β1、PAI-1的表達增高，經Klotho治療后DN腎臟組織的Klotho基因表達增加，同時TGF-β1、PAI-1的表達顯著下降，而無論DN未治療組還是單純腺病毒對照組均未見此種變化，提示Klotho基因可以下調TGF-β1的表達而減少 PAI-1的表達，緩解ECM積聚，延緩DN進展，從而保護DN大鼠腎臟功能。

DN早期腎臟肥大是其進展的始動因素之一，細胞周期調控蛋白是控制細胞生長的關鍵，與DN早期腎臟肥大密切相關〔14〕。p15、p21、p27是細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子(CDKIs)家族的重要成員，是細胞周期的負調控因子，其中p15阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞的分裂增殖，p21基因可使細胞增殖所需的蛋白質磷酸化受阻，在細胞分化和凋亡中p21蛋白的表達增高，p27可阻止細胞通過G1/S期轉化的限制點抑制細胞分裂增殖，使細胞周期停滯在G1期和S期的轉換，使細胞有機會修復損壞的DNA或修復DNA復制過程中產生的錯誤〔15〕。

本研究表明Klotho基因通過下調細胞周期負調控蛋白p15、p21、p27的表達來保護DN大鼠腎臟功能。

綜上所述，Klotho基因能夠下調糖尿病大鼠腎臟TGF-β1、PAI-1、p15、p21、p27基因的表達，對糖尿病大鼠的腎臟具有保護作用，為臨床上治療糖尿病腎病提供新的干預治療靶點和理論依據。

1 王 燕，趙 霞，范 斌，等.2型糖尿病血壓控制與未來出現腎病終點的觀察性研究〔J〕.首都醫科大學學報，2012;33(4):472-6.

2 Wang Y，Sun Z.Current understanding of klotho〔J〕.Aging Res Rev，2009;8(1):43-51.

3 鐘 媛，劉素筠.辛伐他汀與氯沙坦對1型糖尿病大鼠心肌組織Toll樣受體4和核因子-κB表達的影響〔J〕.中國藥物與臨床，2012;12(8):1023-6.

4 王艷嬌，馬厚勛，李寶善，等.腺相關病毒介導的Klotho基因表達對去勢大鼠骨Runx2及MMP-13表達的影響〔J〕.基礎醫學與臨床，2012;32(5):487-92.

5 姜宗培，余學清，陳雄輝，等.轉化生長因子β1對系膜細胞纖溶酶原激活物抑制物1表達的影響〔J〕.中華腎臟病雜志，2004;20(4):260-3.

6 Mariasegaram M，Tesch GH，Verhardt S，et al.Lefty antagonises TGF-β1 induced epithelial-mesenchymal transition in tubular epithelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010;393(4):855-9.

7 Hinz B.Tissue stiffness，latent TGF-β1 activation，and mechanical signal transduction:implication for the pathogenesis and treatment of fibrosis〔J〕.Curr Rheumatol Rep，2009;11(2):120-6.

8 W?gs?ter D，Zhu C，Bj?rck HM，et al.Effects of PDGF-C and PGDF-D on monocyte migration and MMP-2 and MMP-9 expression〔J〕.Atherosclerosis，2009;202(2):415-23.

9 劉亞軍，嚴鐘德.TGF-β1、PAI-1與糖尿病腎病〔J〕.國外醫學·泌尿系統分冊，2000;20(3):107-8.

10 Doi S，Zou Y，Togao O，et al.Klotho inhibits transforming growth factorbeta1(TGF-beta1)signaling and suppresses renal fibrosis and cancer metastasis in mice〔J〕.J Biol Chem，2011;286(10):8655-65.

11 Takeshita K，Yamamoto K，Ito M，et al.Increased expression of plasminogen activator inhibitor-1 with fibrin deposition in a murine model of aging“klotho”mouse〔J〕. SeminThrombHemost，2002;28(6):545-54.

12 Mitani H，Ishizaka N，Aizawa T，et al.In vivo klotho genetransfer ameliorates angiotensinⅡ-induced renal damage〔J〕.Hypertension，2002;39(4):838-43.

13 Lin Y，Kuro-o M，Sun Z.Genetic deficiency of anti-aging gene klotho exacerbates early nephropathy in STZ-induced diabetes in male mice〔J〕.Endocrinology，2013;154(10):3855-63.

14 Wolf G.Cell cycle regulation in diabetic nephropathy〔J〕.Kidney Int(Suppl)，2000;77:S59-66.

15 Hess CJ，Errami A，Berkhof J，et al.Concurrent methylation of promoters from tumor associated genes predicts outcome in acute meyloid leukemia〔J〕.Leuk Lymphoma，2008;49(6):1132-41.