水通道蛋白1和4在大鼠挫傷肺組織中的表達

孫相華 洪文娟 洪志鵬 周 菊 祝艷翠

(昆明醫科大學第一附屬醫院干部醫療科，云南 昆明 650032)

肺挫傷是創傷病人中常出現的一種閉合性損傷，創傷導致的肺組織出血、水腫是急性呼吸窘迫綜合征的主要危險因素，老年患者由于身體各項功能都出現衰退趨勢，加上基礎疾病較多，因此病情更加復雜、兇險，顯著加大了救治難度〔1〕，早期采取有效措施減輕肺水腫對于改善患者預后具有重要意義〔2，3〕，研究肺挫傷水腫的機制，對于肺挫傷患者的臨床治療具有重要的指導意義。本研究檢測水通道蛋白(AQP)1和4在挫傷肺組織中的表達變化，探討肺水腫的形成機制。

1 材料和方法

1.1 肺挫傷模型制作及分組 健康老年雄性SD大鼠100只，體重450～500 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供。肺挫傷模型采用金屬球自由落體打擊法制作，老年大鼠麻醉后放置于水平實驗臺上，180 g重物自1 m高處自由落體，垂直撞擊于大鼠右側胸廓，于設定時間點麻醉后斷頭處死，分為四組:假手術組，模型1、3和6 h組，每組25只，其中10只做水含量測定，10只做分子生物學檢測，5只做組織病理檢測。

1.2 肺組織含水量的測定 大鼠麻醉后取肺組織，稱量右肺中葉肺組織濕重，后置于100℃恒溫鼓風干燥箱中干燥2 d后稱重，計為干重。根據下列公式計算肺組織水含量:(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3 肺組織HE染色 取大鼠右肺上葉組織，4%多聚甲醛固定后，切片，常規脫水、脫蠟，行HE染色。

1.4 RT-PCR 根據標準的RNA提取步驟提取總RNA，使用反轉錄試劑盒(Promega)進行反轉錄，具體操作根據說明書進行。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測各組AQP1和4的表達，以β-actin作為內參照，Image J軟件定量分析各電泳條帶的灰度值，RT-PCR產物以各樣本目的基因與β-actin的灰度值進行比較，AQP1 上游引物序列:5＇-AAAGTGGCAAGGAAGGGACA-3＇;下游引物序列:5＇-GCTGTGGATGTTGGGAAAGAG-3＇。AQP4 的上游引物序列:5＇-TTGGACCAATCATAGGCGC3＇;下游引物序列:5＇-GGTCAATGTCGATCACATGC-3＇;β-actin 上游引物序列:5＇-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3＇;下 游 引 物 序 列:5＇-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3＇。

1.5 Western印跡分析 老年大鼠100 mg肺組織加入裂解液勻漿，冰上碾磨勻漿后，12 000 r/min離心10 min取上清，BCA法蛋白定量，取蛋白樣品50 μg，電泳后轉膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，β-actin、AQP4和1抗體(均購自美國Santa cruz公司)稀釋液孵育(1∶200)，4℃過夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，洗膜后，按照ECL說明書，1∶1配置發光工作液，凝膠成像儀成像。

1.6 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 肺組織濕/干重比和病理改變 模型1、3、6 h組濕/干比重(0.932 4±0.079 6、1.537 8±0.071 3、2.378 0±0.071 3)顯著高于假手術組(0.799 1±0.069 3)(P＜0.05)。模型 3、6 h 組與模型1 h組有顯著差異(P＜0.05)、挫傷后1 h組織肺泡腔內未出現明顯水腫液，3 h后，光鏡下見挫傷肺組織間質出現明顯腫脹，肺泡壁毛細血管出現明顯擴張、紅細胞外漏、水腫明顯，肺泡腔內出現少量水腫液;挫傷后6 h，黏稠液體充滿肺泡腔，肺泡間隔出現明顯水腫，有大量炎性細胞浸潤，假手術組未出現明顯異常。

2.2 各組肺組織AQP1和4的mRNA和蛋白表達量 與假手術組相比，模型3、6 h組肺組織內AQP1和4 mRNA和蛋白表達明顯升高(P＜0.05)。與模型1 h組比較，模型6 h組有顯著差異(P＜0.05)。見圖1 和圖2，表1。

圖1 各組肺組織中AQP1和4 mRNA的RT-PCR電泳

圖2 各組肺組織中AQP1和4蛋白的Western印跡檢測

表1 各組中AQP1和4灰度分析(s，n=10)

表1 各組中AQP1和4灰度分析(s，n=10)

與假手術組相比:1)P＜0.05;與1 h 組相比:2)P＜0.05

假手術組 0.19±0.02 0.08±0.01 0.02±0.01 0.17±0.03模型 1 h 組 0.21±0.05 0.10±0.02 0.19±0.04 0.21±0.06 3 h 組 0.98±0.151)0.78±0.111)0.49±0.061)0.78±0.121)6 h 組 1.02±0.211)2)0.82±0.191)2)1.23±0.211)2)0.85±0.191)2)

3 討論

研究表明彌漫性肺泡損害、低氧血癥、挫傷區肺組織的血水腫、通氣與換氣功能障礙時肺挫傷的主要病理生理機制〔4〕，其中肺水腫是導致肺通氣功能障礙的主要原因，引起肺組織水腫的原因主要有兩方面:一方面，創傷直接破壞血管內皮和肺泡上皮的屏障完整性，使通透性增加〔5〕;另一方面，肺挫傷后繼發性產生的炎性介質，活性氧殘基導致肺泡水的清除能力明顯降低〔4〕。水代謝異常顯著降低了肺組織的順應性和氧合功能，是影響患者預后的重要因素。

研究證實AQP在肺挫傷后組織水腫形成中發揮重要作用，其中，AQP1在肺挫傷后組織中的表達量明顯升高〔6〕，Verkman等〔7〕在敲除AQP1基因的研究發現，AQP1參與滲透壓驅動的肺內水運動，能夠促進肺水腫的形成;袁軍等〔6〕在大鼠肺挫傷模型中研究發現AQP1的表達在肺挫傷后明顯升高，可能是肺水腫的重要參與者。AQP4蛋白最初在1994年從大鼠的肺組織中克隆出來的一種選擇性水轉運體，屬于汞不敏感性AQP家族〔8〕，采用電鏡和免疫細胞化學技術檢測發現AQP4定位于肺組織的氣管、支氣管上皮及成纖維細胞的膜基質側頂部，此外AQP4也存在于氣管、支氣管的柱狀上皮的基質側，AQP4在肺泡水的轉運及氣道表面液體的調整中發揮重要作用。Verkman等〔7〕證實發現AQP1缺失可導致肺泡毛細血管間的水通透性下降10倍，AQP1和4均敲除小鼠水通透性降低14～16倍。研究采用血管外肺水(EVLW)技術發現，AQP4的主要作用是保持肺泡相對干燥，在正常狀態下表達較少，血管外肺水量的增加可以顯著誘導AQP4蛋白表達，以糾正“滲出-吸收”的失衡〔7，9〕。朱麗華等〔10〕在大鼠油酸性急性肺損傷模型中發現，AQP4在油酸導致損傷的肺組織中表達明顯升高，這與本實驗的研究結果具有一致性，同時還證明早期使用腎上腺能β2受體激動劑特布他林可以上調肺泡Ⅱ型細胞AQP4表達，明顯減少肺泡腔滲出，減輕肺損傷，顯著減少細胞外肺水的含量，提示AQP4在肺泡水腫中可以加強水轉運發揮重要的抗水腫作用;推測肺挫傷后AQP4表達升高，是一種肺挫傷后的代償性升高，可能利于減輕肺泡腔水腫。以往研究證實AQP1在肺挫傷后表達也明顯升高，本研究結果與前期研究具有一致性〔11，12〕，AQP1 蛋白的表達增加則可以加重肺水腫，因此調節二者比值的平衡可能對于肺水腫早期的治療具有重要意義，未來還需要進一步使用敲除AQP4或1基因及兩者同時敲除的基因驗證二者在肺挫傷中肺水腫的作用。

1 李景華.老年人嚴重肺挫傷的治療體會〔J〕.現代診斷與治療，2012;23(5):508-9.

2 羅玉龍，李超峰，蘇鵬霄.嚴重肺挫傷150例診治體會〔J〕.吉林醫學，2009;30(19):2244-6.

3 Feden JP.Closed lung trauma〔J〕.Clin Sports Med，2013;32(2):255-65.

4 Simon B，Ebert J，Bokhari F，et al.Management of pulmonary contusion and flail chest:an Eastern Association for the Surgery of Trauma practice management guideline〔J〕.J Trauma Acute Care Surg，2012;73(5 Suppl 4):S351-61.

5 Gokce M，Saydam O，Hanci V，et al.Antioxidant vitamins C，E and coenzyme Q10 vs dexamethasone:comparisons of their effects in pulmonary contusion model〔J〕.J Cardiothorac Surg，2012;7:92.

6 袁 軍，陳 陽，程利寶.大鼠挫傷肺組織中水通道蛋白1表達變化〔J〕.法醫學雜志，2009;25(2):85-7.

7 Verkman AS.Role of aquaporins in lung liquid physiology〔J〕.Respir Physiol Neurobiol，2007;159(3):324-30.

8 Badaut J，Fukuda AM，Jullienne A，et al.Aquaporin and brain diseases〔J〕.Biochim Biophys Acta，2013;205(7):154-60.

9 Song Y，Fukuda N，Bai C，et al.Role of aquaporins in alveolar fluid clearance in neonatal and adult lung，and in oedema formation following acute lung injury:studies in transgenic aquaporin null mice〔J〕.J Physiol，2000;525(3):771-9.

10 朱麗華，李濤平，何 琳.大鼠油酸性急性肺損傷初期水通道蛋白4在肺水代謝的實驗研究〔J〕.南方醫科大學學報，2008;28(5):707-11.

11 王騰騰，王道喜.水通道蛋白1在大鼠挫傷肺損傷中的表達變化〔J〕.中國醫學工程，2012;20(3):160-1.

12 Bai C，Fukuda N，Song Y，et al.Lung fluid transport in aquaporin-1 and aquaporin-4 knockout mice〔J〕.J Clin Invest，1999;103(4):555-61.