pGPU6/GFP質粒介導的表達鈣網織蛋白基因的短發夾RNA的構建和鑒定

李曉曦 孟凡東 孫大鵬 仇鳳啟 劉新莉 趙 丹 馬 萍

(中國醫科大學附屬第一醫院腫瘤研究所二室，遼寧 沈陽 110001)

乳腺癌發病率占全身各種惡性腫瘤的7% ～10%，在美國乳腺癌的年發病率已接近130/10萬人口〔1〕。在傳統的手術、放療和化療基礎上，應用生物治療是腫瘤治療的新方向。近來研究發現構建靶向鈣網織蛋白(CRT)除鈣在心血管系統中的調節作用外，在腫瘤的血管形成，侵襲轉移和凋亡方面也有一定作用〔2〕。近年來，RNA干擾(RNAi)越來越為人們所重視。RNAi是一種進化上保守的基因組水平的免疫監控機制，是多步驟過程，通過RNaseⅢ內切核酸酶Dicer的作用產生小的(21～23 nt)短干擾性RNA(siR2NA)，介導其互補同源mRNA序列的特異性降解〔3，4〕。本項研究擬利用基因克隆技術構建表達CRT shRNA的質粒，為研究CRT基因在乳腺癌細胞株凋亡、侵襲和轉移方面的作用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pGPU6/GFP載體購自上海吉瑪公司;限制性內切酶 Pst I、BamH I、Bbs I、T4 DNA L Ligase 購自美國 NEB 公司;膠回收試劑盒購自Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa);質粒抽提試劑盒購自Axygen。Lipofectamine 2000轉染試劑為Invitrogen公司產品。人乳腺癌細胞MDA-MB-231、大腸桿菌DH5a為本實驗室保存;RPMI 1640培養基購自Thermo公司;標準胎牛血清購自Boermei公司。

1.2 方法

1.2.1 CRT siRNA轉錄模板DNA鏈的設計、合成 人CRT mRNA的序列信息從NCBI Entrez核苷酸數據庫獲得。CRT基因的兩個靶位置從人CRT mRNA序列中選擇(Genebank Accession NG_029662)，分別選擇CRT編碼序列中第359～379，535～555，747～767，1 051～1 071特異性序列為siRNA的正義鏈。經Blast Search檢索確認與EGFR以外的人類已知基因序列無同源性。由上海吉瑪公司設計、合成1#，2#，3#，4#CRT 4對shRNA。shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5'端添加了CACC，與BbsI酶切后形成的黏端互補;反義鏈模板的5'端添加了GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補;如果siRNA的第一個堿基不是G，則在CACC后補加一個G。序列如下:1#S:5'-CACCGCAGT TCACGGTGA AACATGATT CAAGAGATC ATGTTTCAC CGTGAACTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCAGTTC ACGGTGAAA CATGATCTC TTGAATCAT GTTTCACCG TGAACTGC-3';2#S:5'-CACCGCAAG AACGTGCTG ATCAACATT CAAGAGATG TTGATCAGC ACGTTCTTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCAAGAA CGTGCTGAT CAACATCTC TTGAATGTT GATCAGCAC GTTCTTGC-3';3#S:5'-CACCGCCAA GATCGATGA TCCCACATT CAAGAGATG TGGGATCAT CGATCTTGG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCCAAGA TCGATGATC CCACATCTC TTGAATGTG GGATCATCG ATCTTGGC-3';4#S:5'-CACCGCACC ATCTTTGAC AACTTCCTT CAAGAGAGG AAGTTGTCA AAGATGGTG CTTTTTTG-3'，A:5'-GATCCAAAA AAGCACCAT CTTTGACAA CTTCCTCTC TTGAAGGAA GTTGTCAAA GATGGTGC-3'。

1.2.2 重組質粒pGPU6/GFP/Neo-CRT shRNA的構建 將DNA oligo 分別用 TE(pH 8.0)溶解，濃度為 100 μmol/L。按說明配比反應體系，在PCR儀上按照如下程序進行退火處理:95℃ 5 min;85℃ 5 min;75℃ 5 min;70℃ 5 min;4℃保存。退火處理后得到濃度為10 μmol/L的shRNA模板。將所得模板溶液稀釋500倍，終濃度為20 nmol/L，用于連接反應。BamHⅠ和BbsⅠ在 37℃ 酶切質粒 pGPU6/GFP/Neo 1 h，瓊脂糖凝膠電泳，膠回收線性化質粒。用T4連接酶將退火DNA定向插入到空載體中。將重組體轉化感受態大腸桿菌DH5a，每個連接反應挑取5個菌落，接種到含50 μg/ml Kanamycin的LB培養集中篩選陽性克隆，使用堿裂解法抽提質粒。

1.2.3 重組質粒的鑒定 所得質粒用BamHⅠ，PstⅠ分別酶切鑒定(圖1)。陽性重組載體應該可以被BamHⅠ酶切，而不能被PstⅠ酶切。每組選擇兩個克隆送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。

1.2.4 細胞培養及轉染 MDA-MB-231細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于5%CO2、37℃ 飽和濕度的恒溫培養箱中常規培養。每天觀察細胞的生長狀態，適時換液、傳代。當細胞處于對數生長期，且存活細胞百分率均在95%以上時，用0.25%胰酶消化后鋪6孔板，每孔接種5×105個細，隔日進行轉染。用無血清RPMI1640 250 μl稀釋4 μg質粒載體和10 μl Lipofectamine 2000轉染試劑靜置5 min后混合20 min加入6孔板中進行轉染。轉染48 h后，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。

1.2.5 轉染細胞及總蛋白的提取 收集轉染48 h后的MDAMB-231細胞，以RIPA法提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。于-80℃保存備用。

1.2.6 細胞中CRT蛋白表達的檢測 采用Western印跡法。取提取的5種質粒轉染細胞的總蛋白各40 μg，經10%SDSPAGE分離后，電轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 4℃封閉過夜;加入兔抗CRT抗體(1∶1 000稀釋)，4℃孵育6 h;TBST洗滌2次，TBS洗滌1次，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶200稀釋)，37℃孵育2 h;洗膜，ECL發光，Bio-Rad凝膠成像系統進行圖像采集。

2 結果

2.1 重組質粒鑒定 pGPU6/GFP/Neo-CRT經酶切后電泳，可觀察到在5 000 bp和100 bp左右各有1條帶，符合pGPU6/GFP/Neo質粒(5 117 bp)及插入的siRNA片段(58 bp)的特征(見圖1)。

圖1 重組載體的酶切鑒定

2.2 測序分析 將重組質粒pGPU6/GFP/Neo-CRT1，pGPU6/GFP/Neo-CRT2，pGPU6/GFP/Neo-CRT3 和 pGPU6/GFP/Neo-CRT4送上海英駿生物技術有限公司測序鑒定。測序結果均與目的序列相同。見圖2。

2.3 重組質粒的轉染效果 熒光顯微鏡下觀察顯示，轉染48 h后，5種重組質粒轉染的MDA-MB-231細胞中均可見明顯的綠色熒光，表明重組質粒已成功轉入細胞。見圖3。

2.4 各組細胞中CRT蛋白的表達 Western印跡法分析顯示，重組質粒 pGPU6/GFP/Neo-CRT1，pGPU6/GFP/Neo-CRT2，pGPU6/GFP/Neo-CRT3及 pGPU6/GFP/Neo-CRT4均可抑制MDA-MB-231細胞中CRT蛋白的表達，其中pGPU6/GFP/Neo-CRT1質粒的抑制作用最為顯著。見圖4。

圖2 測序分析

圖3 轉染MDA-MD-231細胞圖片(×100)

圖4 Western印跡法分析各組細胞中CRT蛋白的表達

3 討論

CRT是一種在調節細胞功能方面有作用的多功能蛋白，廣泛分布在有核細胞的內質網表面〔5〕，其在防止新蛋白合成過程中的蛋白聚合和協助蛋白正確折疊方面有重要作用并有效調節體內 Ca2+的平衡〔6〕。

RNAi是由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。與其他基因沉默技術相比，其具有高效抑制基因的表達及高度的序列特異性的優點〔8〕。shRNA在體內加工后形成類似siRNAs的分子，引發基因沉默。有研究表明，通過質粒表達siRNA并攜帶進入細胞內可以抑制特定基因的表達〔9，10〕。

本實驗針對CRT基因設計、合成了4對正、反義RNA干擾寡核苷酸鏈，退火形成雙鏈，與雙酶切的載體pGPU6/GFP連接后轉染MDA-MB-231細胞。利用實時定量PCR和Western印跡技術檢測靶基因被抑制的效果，并篩選出了最有效的干擾質粒pGPU6/GFP/Neo-CRT1，避免僅設計1組干擾序列導致的干擾效果無對照，無法選擇干擾效率最優的質粒進入后續實驗的問題，從而為進一步研究該基因在乳腺癌凋亡、侵襲及轉移中的作用奠定了基礎。

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