胃癌組織中CHD1L表達及其臨床意義

袁存存，焦 鋒，胡 海

(1河南大學附屬鄭州市第一人民醫院，鄭州450004;2上海交通大學)

侵襲與轉移是胃癌預后不良的主要生物學特征。染色質解旋酶DNA結合蛋白1樣基因(CHD1L)是SNF-2類家族成員，具有高度保守的解旋酶功能，可重組染色質、調控轉錄以及調節DNA與蛋白質之間的相互作用［1］。研究發現CHD1L陽性表達與多種腫瘤的侵襲、轉移以及預后密切相關［2～4］。為探討CHD1L在胃癌發生發展中的作用，我們于2011年1月～2013年10月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株AGS、N87、HGC-27(各1株)、正常胃黏膜上皮細胞GES-1由鄭州市第一人民醫院中心實驗室液氮凍存。同期于我院腫瘤外科接受手術的71例胃癌患者的癌組織及其配對癌旁組織(距病灶組織2 cm)石蠟標本(患者男38例，女33例，年齡36～73歲，中位年齡61.6歲;均有完整的臨床資料，且經病理檢查確診;腫瘤直徑≤5 cm者35例，＞ 5 cm者36例)，TNM 分期:Ⅰ期、Ⅱ期28例，Ⅲ期、Ⅳ期43例;組織學分級:高分化42例，中低分化29例;有淋巴結轉移39例。RPMI 1640培基、小牛血清(Gibco公司)，RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒(Takara公司)，PCR試劑盒(Takara公司)，CHD1L基因及GAPDH基因引物 (上海生工公司合成)。RIPA裂解液、PMSF、蛋白定量BCA試劑盒(碧云天生物技術公司)，鼠抗人CHD1L單克隆抗體(Abcam公司)，兔抗人GAPDH多克隆抗體(Cell signaling technology公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胃癌細胞株CHD1L mRNA及蛋白表達檢測將AGS、N87、HGC-27及GES-1細胞置于10% 小牛血清的RPMI 1640培養液，37℃ 、5%CO2培養箱中飽和濕度下培養。穩定傳代2～3代后取對數生長期細胞，分別采用RT-PCR和Western blot法檢測CHD1L mRNA和蛋白表達。

1.2.2 胃癌組織及其癌旁組織CHD1L蛋白表達檢測 采用免疫組化法。71份胃癌及癌旁組織標本均行4 μm連續切片，S-ABC法染色;二甲苯脫臘，乙醇水化后行抗原修復，4%H2O2阻斷10 min，滴加5%BSA封閉液，37℃封閉1 h，滴加一抗4℃過夜(以自身作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照)，生物素化二抗孵育1 h，顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。于光鏡(×400)下每張切片選取5個有代表性的區域，每個區域選150～200個細胞，按染色細胞比例和顯色強度計分。染色細胞比例計分:未發現染色細胞為陰性，計0分，染色細胞≤10%、～50%、～80%、＞80%分別計1、2、3、4分;顯色強度計分:未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分。兩項計分的乘積＜4為CHD1L蛋白表達陰性，≥4為陽性。分析CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數的關系。

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS13.0軟件進行處理，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞系CHD1L mRNA和蛋白表達 3株胃癌細胞 CHD1L mRNA和蛋白均呈高表達，與GES-1細胞比較，P均＜0.05。見圖1。

圖1 AGS、N87、HGC-27 及 GES-1 細胞CHD1L mRNA和蛋白表達

2.2 胃癌組織及癌旁組織CHD1L蛋白表達 胃癌組織及癌旁組織CHD1L蛋白陽性率分別為49.3%(35/71)、11.3%(8/71)，χ2=24.317，P ＜ 0.05。CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數的關系見表1。由表1可見，CHD1L蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑無關，而與腫瘤TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)。

表1 CHD1L蛋白表達與胃癌臨床病理參數的關系

3 討論

胃癌的發生發展是多因素、多步驟參與的復雜過程，涉及到癌基因以及轉移相關基因的激活、抑癌基因的缺失等［5］。明確胃癌發生發展過程中關鍵基因的擴增及激活情況，檢測胃癌關鍵基因的表達有助于腫瘤的診斷、分期及預后判斷［6，7］。

CHD1L是香港大學關新元教授用染色體顯微切割結合篩選雜交技術從人肝細胞的染色體lq21區首次分離并克隆的一個新基因［8］。通過對CHDIL基因的同源性和功能結構域的分析研究發現，其屬于 SNF-2類家族。SNF-2類家族成員如Snf2、ISWI和CHDl均含有一個大約400個氨基酸的結構域，具有高度保守的解旋酶功能。CHDIL與CHDl的解旋酶區域的同源序列是59%。與CHDl不同的是，CHDIL不包含可以識別甲基化組蛋白末端染色體結構［9］，但其羧基末端包含一個較大的區域，此為ADP-ribose/PAR-binding元件，可調控DNA損傷修復和細胞周期演進［10，11］。

研究發現，肝癌組織中CHD1L在基因水平擴增的比例是50.6%(86/140)，蛋白水平過表達的比例是52.4%(163/311);轉染CHD1L后的肝癌細胞具有更強的致瘤能力［8］。進一步分析發現CHD1L的過表達與靜脈浸潤、腫瘤分期高、預后差密切相關［3，12］。此外，肝癌手術后患者高表達 CHD1L 者預示著其無疾病生存時間短［13］;膀胱癌組織中CHD1L表達也影響患者的預后以及生存［14］。本研究結果顯示，3株人胃癌細胞系中CHD1L mRNA和蛋白表達水平均明顯高于正常胃黏膜細胞;71份胃癌組織CHD1L蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁組織。有報道胃癌組織與癌旁組織的CHD1L陽性率分別為58.7與7.3%，本研究結果與其基本一致，但癌旁組織的陽性率似明顯高于其報道，可能與納入研究者個體差異及免疫組化評分標準不同有關。進一步分析胃癌組織中CHD1L的表達水平與臨床病理因素的關系發現，CHD1L蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小無關，而與腫瘤TNM分期、分化程度以及淋巴結轉移有關;即CHD1L蛋白表達陽性率高者腫瘤TNM分期高、分化程度低、淋巴結轉移率高。CHD1L促進腫瘤生長以及轉移的分子機制可能涉及到以下幾個方面:①下調腫瘤蛋白p53(TP53)以及TP53蛋白的下游效應基因周期素依賴激酶抑制劑1A，有利于激活周期素E-周期素依賴性激酶2復合物，該復合物能滅活G1/S期磷酸化的視網膜母細胞瘤蛋白，釋放轉錄因子E2F，促進細胞快速進入S期，促進DNA合成，從而調控細胞的增殖及凋亡［3］;②與核受體 4亞族 A組成員 1(NR4A1，又稱Nur77)結合，抑制Nur77從細胞核移至線粒體內，阻礙細胞色素C向細胞質釋放，抑制細胞凋亡蛋白酶3和蛋白酶9的活性，進而抑制細胞凋亡［15］;③通過細胞分裂周期42鳥苷酸交換因子介導細胞分裂周期42基因的激活，增強細胞的游動性及誘導絲狀偽足細胞形成及上皮細胞向間充質細胞轉化，增強腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移能力［16］。但CHD1L促進胃癌發生發展的分子機制如何，是否還存在其他的信號通路，仍有待進一步探究。

分析本研究結果，CHD1L蛋白陽性表達。可促進腫瘤的侵襲和轉移;CHD1L表達可作為判定胃癌惡性表型的指標之一。今后需進一步對CHD1L在胃癌中的表達水平進行分級并完善隨訪數據，探討CHD1L表達水平與患者預后的關系。

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