TK基因治療庫(kù)欣病的實(shí)驗(yàn)研究

宋慶鑫，王建鵬，陰曉峰，相恒偉，劉 霞，張 欣，孫 鵬

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床系，山東青島266071;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院黃島分院)

庫(kù)欣病是由于垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)腺瘤或ACTH細(xì)胞增生，使垂體分泌過(guò)量ACTH引起腎上腺皮質(zhì)增生、皮質(zhì)醇增多癥、物質(zhì)代謝紊亂和一系列病理變化。當(dāng)腫瘤＜1 cm時(shí)可通過(guò)手術(shù)切除，治愈率為75%～80%［1］;腫瘤較大時(shí)治愈率則低于50%［2］。藥物治療和放射治療為庫(kù)欣病的輔助療法，但治療效果不明顯［3，4］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，很多遺傳疾病和腫瘤已經(jīng)嘗試行基因治療，采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染有毒基因進(jìn)入目的細(xì)胞，可達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的［5、6］。基因的靶向性表達(dá)是基因治療的一個(gè)重要因素，要求腺病毒轉(zhuǎn)染的基因必須高水平表達(dá)且能選擇性的在特定細(xì)胞中表達(dá)。2013年9月～2013年11月，我們觀察了阿黑皮素原(POMC)啟動(dòng)子調(diào)控的單純孢疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(以下簡(jiǎn)稱(chēng)TK基因)在小鼠AtT20細(xì)胞中的靶向性表達(dá)，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其用于庫(kù)欣病治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠垂體瘤細(xì)胞 AtT-20/D16v-F2(以下簡(jiǎn)稱(chēng)AtT20)購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司;人乳腺癌細(xì)胞T47D購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司;腺病毒載體AdPOMCTK購(gòu)自北京諾賽基因組研究中心公司;非放射性細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)有限公司。核苷類(lèi)似物更昔洛韋(GCV)購(gòu)自湖北科益藥業(yè)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠AtT20細(xì)胞于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培育，T47D細(xì)胞于在含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基中培育;培養(yǎng)基中均含有濃度為100 U/mL的青霉素及鏈霉素。所有培養(yǎng)基均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于研究。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及TK基因表達(dá)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AtT20細(xì)胞和T47D細(xì)胞按2×105/mL的密度分別接種于12孔板。培養(yǎng)24 h后，分別采用感染復(fù)數(shù)(MOI)為10 PFU/cell的AdPOMCTK轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組)，空白組替換成等量PBS溶液。轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS沖洗細(xì)胞2次，再將細(xì)胞置于0.3 mL的緩沖液中。將樣品在干冰乙醇浴中冷卻后置于37℃水浴，重復(fù)3次。裂解細(xì)胞，將裂解液置于離心管中，4℃離心20 min，上清液置于-70℃保存。提取蛋白，用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上;用含5%脫脂奶粉的TBST常溫密閉2 h后，加入一抗:兔源多克隆HSV-TK抗體(1∶800)，4℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液漂洗10 min×3次后加入二抗:HRP標(biāo)記的goat anti-rabbit IgG，常溫1 h;TBST緩沖液漂洗10 min×3次;顯色，壓片，顯影，定影;觀察TK基因表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)GCV的敏感性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AtT20細(xì)胞和T47D細(xì)胞以5×103/mL的密度接種于 96 孔板中 ，分別采用 MOI為 0、0.5、1、5、10、100 PFU/cell的AdPOMCTK轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染1 h后，以分別加入0、0.5、2.5和5 mg/mL濃度的 GCV 和新鮮培養(yǎng)基，每2天添加1次，第4天應(yīng)用非放射性細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒測(cè)定轉(zhuǎn)染后AtT20細(xì)胞對(duì)GCV的敏感性，即細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=GCV干預(yù)細(xì)胞的吸光度/GCV未干預(yù)細(xì)胞的吸光度×100%。

1.2.4 旁觀者效應(yīng)觀察 將轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染 Ad-POMCTK 的 AtT20 細(xì)胞分別以 1∶4、2∶3、3∶2 和 4∶1的比例混合，以4×103個(gè)/mL的密度接種于96孔板中。培養(yǎng)1 d后，實(shí)驗(yàn)組加入濃度為10 μg/mL的GCV，對(duì)照組加入等量PBS溶液，每隔2天添液1次。4 d后檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同更昔洛韋濃度及MOI轉(zhuǎn)染濃度間細(xì)胞存活率差異的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析法，不同轉(zhuǎn)染方式間細(xì)胞存活率的差異比較采用成組設(shè)計(jì)的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TK基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染后48 h，AtT20細(xì)胞有明顯的蛋白條帶，分子量為46 K。T47D細(xì)胞無(wú)明顯蛋白條帶，空白組完全沒(méi)有目的基因表達(dá)。說(shuō)明TK基因已轉(zhuǎn)染入AtT20細(xì)胞，并成功表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 AtT20細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TK基因表達(dá)

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)GCV的敏感性 ①AtT20細(xì)胞:細(xì)胞存活率隨MOI的升高而降低(F=448110.467，P＜0.001);隨 GCV濃度升高而降低(F=360780.586，P ＜0.001);GCV 濃度與 MOI濃度間存在顯著的交互效應(yīng)(F=28574.837，P ＜0.001)。在各MOI濃度時(shí)，細(xì)胞存活率均隨GCV濃度增加而降低。當(dāng)GCV濃度為0 mg/L時(shí)，除0.5與1的MOI濃度間差異不顯著外，其它兩兩比較均有顯著差異;當(dāng)GCV濃度為0.5～5 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率均隨MOI濃度增加而降低。見(jiàn)表1。②T47D細(xì)胞:細(xì)胞存活率隨GCV 濃度升高而降低 (F=3.243，P=0.027);隨MOI濃度升高而降低(F=1874.888，P ＜0.001);GCV 濃度與MOI濃度間的交互作用不顯著(F=0.293，P=0.995)。見(jiàn)表2。

表1 不同GCV濃度及MOI濃度作用后AtT20 細(xì)胞存活率比較(n=4， ±s)

表1 不同GCV濃度及MOI濃度作用后AtT20 細(xì)胞存活率比較(n=4， ±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 99.00 ±0.37 99.65 ±0.24 94.95 ±0.13 91.95 ±0.MOI(PUF/cell)細(xì)胞存活率(%)24 0.5 99.60 ±0.18 69.03 ±0.13 53.05 ±0.13 40.00 ±0.18 1 99.50 ±0.22 44.33 ±0.13 35.90 ±0.14 29.18 ±0.13 5 98.55 ±0.17 26.33 ±0.17 18.83 ±0.15 17.03 ±0.13 10 98.08 ±0.13 23.20 ±0.14 16.05 ±0.13 7.55 ±0.21 100 34.23 ±0.21 11.28 ±0.13 7.68 ±0.22 4.98 ±0.28

表2 不同GCV濃度及MOI濃度作用后T47D 細(xì)胞存活率比較(n=4，±s)

表2 不同GCV濃度及MOI濃度作用后T47D 細(xì)胞存活率比較(n=4，±s)

GCV0 mg/L GCV0.5 mg/L GCV2.5 mg/L GCV5 mg/L 0 98.60 ±0.75 98.95 ±0.97 98.38 ±0.83 98.20 ±0.MOI(PUF/cell)細(xì)胞存活率(%)88 0.5 98.88 ±0.83 98.05 ±1.10 98.13 ±0.91 98.03 ±0.97 1 98.83 ±0.79 98.40 ±0.42 97.80 ±1.12 97.80 ±0.77 5 98.38 ±0.69 98.03 ±0.86 97.98 ±0.88 97.85 ±0.47 10 98.00 ±0.51 98.23 ±0.71 97.90 ±0.68 97.50 ±0.71 100 77.25 ±1.05 76.78 ±0.41 76.58 ±0.72 76.55 ±0.79

3 討論

在激素分泌性垂體腺瘤中庫(kù)欣病占5%～10%，由于垂體分泌過(guò)量ACTH，引起腎上腺皮質(zhì)增生，產(chǎn)生皮質(zhì)醇增多，引起下丘腦—垂體—腎上腺軸機(jī)能紊亂，導(dǎo)致一系列物質(zhì)代謝紊亂和病理變化。庫(kù)欣病是一種耗竭性疾病，很少能自行緩解，若不及時(shí)診治，死亡率較高。經(jīng)鼻—蝶竇垂體手術(shù)為治療庫(kù)欣病的有效方法［7］，但多數(shù)患者仍難以治愈。

近年來(lái)基因治療成為腫瘤治療的新策略。基因治療的最大問(wèn)題是基因的特異性表達(dá)，毒性基因在特定細(xì)胞中表達(dá)成為一個(gè)重要的突破點(diǎn)。研究表明POMC啟動(dòng)子可以在AtT20細(xì)胞中很好的表達(dá)。本研究證實(shí)帶POMC啟動(dòng)子的腺病毒載體能轉(zhuǎn)染入AtT20細(xì)胞中并成功表達(dá)，在T47D細(xì)胞中卻不能明顯表達(dá)，說(shuō)明腺病毒載體的轉(zhuǎn)染具有靶向性。毒性基因通常選用HSV-TK基因，應(yīng)用人工合成的核苷類(lèi)似物GCV激活TK基因，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。腫瘤細(xì)胞內(nèi)TK基因表達(dá)的胸苷激酶可催化GCV形成單磷酸化產(chǎn)物，并在細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶的作用下形成三磷酸 GCV，后者可阻礙 DNA 合成［9，10］。通過(guò)調(diào)節(jié)GCV劑量來(lái)激活毒性基因的方法為垂體腺瘤的治療提供了一個(gè)嶄新的視角和可行的方案。TK基因在腫瘤治療方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，其誘導(dǎo)形成的三磷酸GCV僅對(duì)分裂期細(xì)胞產(chǎn)生毒性，而對(duì)低有絲分裂指數(shù)的正常細(xì)胞無(wú)毒性作用，即其殺傷作用僅局限于腫瘤細(xì)胞［11］。此為其治療腫瘤提供了可靠的理論依據(jù)［12］。

TK基因作為毒性基因的另一好處是其具有旁觀者效應(yīng)［13］。這種效應(yīng)反映了HSV-TK誘導(dǎo)的三磷酸GCV可通過(guò)細(xì)胞間隙連接細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系，從而殺死相鄰的細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞中只有20%表達(dá)TK基因就產(chǎn)生對(duì)GCV明顯的敏感性;而感染相同數(shù)量的AdPOMCTK細(xì)胞經(jīng)GCV治療后可引起95%以上的細(xì)胞死亡，證實(shí)TK基因治療庫(kù)欣病具有良好的效果。

本研究結(jié)果顯示，AdPOMCTK可在AtT20細(xì)胞中有效表達(dá)有毒基因，且具有靶向性。AdPOMCTK及其類(lèi)似的病毒載體有望用于庫(kù)欣病的基因治療。目前需解決的問(wèn)題是需進(jìn)一步確定重組腺病毒的有效性和安全性。

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