抗VEGF抗體對人膽管癌移植瘤裸鼠模型的治療作用觀察

馮 亮，李志鈺

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150001)

膽管癌臨床癥狀出現較晚，早期診斷困難，容易向周圍組織浸潤、轉移，外科手術切除率低，且對放化療不敏感，預后較差，3 年生存率 ＜11%［1，2］。深入研究膽管癌的發病機制并尋求新的治療途徑是目前研究熱點。Bevacizumab是針對VEGF的單克隆抗體，可通過阻斷VEGF與受體的結合而抑制腫瘤組織血管生成，對肺癌、乳腺癌和結直腸癌血管生成有一定作用［3］，對肝癌細胞株也有一定的抑制作用，但其對膽管癌能否發揮抗血管生成作用目前鮮見報道。2012年1～12月，我們觀察了Bevacizumab單克隆抗體對裸鼠膽管癌血管生成的抑制作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 55只BALB/c-nu裸小鼠，5～6周齡，體質量18～22 g;SPF環境下飼養。人膽管癌細胞株QBC939細胞株購自上海復祥生物科技有限公司;Bevacizumab(商品名 Avastin)為 Genentech Inc產品;兔抗人VEGF抗體、兔抗人CD34抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 膽管癌移植瘤模型制作及干預 將QBC939細胞株(1×106個)接種于小鼠右腋窩皮下。接種后觀察腫瘤生長情況，腫瘤直徑約0.5 cm(游標卡尺測量)時即用于實驗。將動物隨機分為對照組15只，藥物1組及藥物2組各20只。對照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/次，藥物1組及藥物2組分別腹腔注射Bevacizumab 5、10 mg/kg;均每周2次，連續給藥4周。

1.3 觀察項目

1.3.1 腫瘤體積 治療前及每次治療時測量腫瘤體積(=1/2×長徑×短徑2)，共8次。

1.3.2 腫瘤組織VEGF表達 治療結束后1周處死小鼠取移植瘤組織，常規步驟制作石蠟包埋標本，連續4 mm切片，采用免疫組化SP法檢測VEGF表達。胞質棕黃色著色為陽性細胞。陽性細胞數25%以下為陰性(-);25%～50%為弱陽性(+);50%～75%為陽性(++);75%以上為強陽性(+++)。(-)與(+)為低表達，(++)與(+++)為高表達。

1.3.3 腫瘤微血管密度(MVD) 參考Weidner改進方法［4］，以 CD34陽性血管數作為微血管密度(MVD)，先于低倍鏡下(50×)確定熱點處，再于高倍鏡下(200×)任選不重復的5個視野，計數陽性血管數，取平均數為MVD。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件行統計學處理。計量資料采用±s表示，治療前后比較采用方差分析，治療后組間比較采用方差分析;計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

藥物2組用藥3周后小鼠死亡2只，藥物1組及對照組無死亡。

2.1 腫瘤體積 用藥后各觀察點藥物1組及藥物2組腫瘤體積，但兩組無統計學差異。但均明顯小于對照組(P均＜0.05);三組腫瘤體積變化趨勢見圖1。

圖1 各組用藥第1～4周移植瘤體積變化

2.2 VEGF表達水平 藥物2組、藥物1組、對照組 VEGF 陽性率分別為 53.5%、56.6%、68.5%，三組間比較無統計學意義;藥物2組、藥物1組、對照組VEGF高表達率分別為72%、75%、80%，藥物2組、藥物1組均低于對照組，P＜0.05。

2.3 MVD 藥物2組及藥物1組MVD分別為23.50 ± 3.23和 23.50 ± 3.23，對照組為55.86 ±4.73;藥物2組及藥物1組均低于對照組(P＜0.05)，但藥物2組及藥物1組比較無顯著差異。

3 討論

近年來針對腫瘤相關因子的靶向治療成為腫瘤防治的重要策略。由于血管生成對于腫瘤生長和轉移具有重要作用，使得抗血管生成治療成為一個獨立性策略［5］。

血管生成是一個由已存在的血管內皮增殖、遷移，生長出新毛細血管的過程。腫瘤血管生成是由包括腫瘤細胞、內皮細胞、細胞外基質等構成的腫瘤微環境的共同作用，在特定作用下刺激毛細血管內皮細胞的增殖;其中VEGF信號通路起關鍵作用。研究發現多種腫瘤細胞以及巨噬細胞可以分泌VEGF［6，7］，VEGF 與血管內皮上的受體(VEGFR)結合，激活受體自身磷酸化并啟動一系列下游信號活動，促進內皮細胞增殖、侵襲和遷移，導致新生血管形成，并改變血管通透性［8，9］，而大量新生血管形成是直徑＞2 mm的腫瘤繼續生長必不可少的條件;抑制VEGF誘導的血管生成信號理論上可阻斷合成血管的必要成分并改變其通透性［5，10，11］。有報道，40%～60%的膽管癌病例癌組織VEGF呈高表達，說明VEGF過度表達可促進腫瘤發展;有研究認為膽管癌組織VEGF的表達強度與膽管癌的病理分期、淋巴結轉移等有相關性，VEGF表達越強，患者的預后越差［12，13］;故理論上針對VEGF的治療也能起到抑制血管生成的作用。

Bevacizumab為重組人單克隆抗體，是第一個在固體腫瘤中顯示出有效性的抗血管生成藥物，FDA已批準其用于結直腸癌、肺癌、乳腺癌等的治療，特別是對于晚期腫瘤患者能延長生存期、提高生存質量［14，15］。本研究結果顯示，與對照組比較，兩藥物組腫瘤體積增長較緩慢，說明Bevacizumab可抑制腫瘤生長;兩藥物組腫瘤中心以及周邊區域MVD均明顯少于對照組，說明Bevacizumab具有抑制血管生成的作用，與此前相關報道一致［16～18］。Bevacizumab的作用機制為能夠結合細胞外VEGF并阻止其與內皮細胞上受體 (Flt-1及 KDR)結合，進而抑制血管生成［19］。由于Bevacizumab為針對VEGF的單克隆抗體，也驗證了在膽管癌中VEGF異常表達所導致的促進腫瘤生長作用，同時證實了采用抗VEGF抗體阻斷血管生成治療對于控制膽管癌進展的有效性。有報道認為Bevacizumab具有抑制腫瘤細胞VEGF表達，并促進腫瘤細胞凋亡的作用［20］，本研究兩藥物組腫瘤組織VEGF表達陽性率較對照組降低，但并不顯著，說明Bevacizumab對膽管癌的抑瘤作用主要取決于其對血管生成的抑制作用。

一般認為人類對Bevacizumab的耐受性較好，推薦劑量不會出現不良反應。本研究藥物1組未出現明顯的藥物毒性反應，但藥物2組出現小鼠死亡的現象，考慮為裸小鼠的耐受量比人低。提示應用Bevacizumab時應參考推薦劑量。

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