高表達重組人組織激肽釋放酶7基因的前列腺癌單克隆細胞株的構建

林志弟，莫林鍵，張成東，宣 強，張悅寧，莫曾南，滕若冰，楊小麗，

(1廣西醫科大學第一附屬醫院;2廣西醫科大學醫學科學實驗中心)

前列腺癌是成年男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國其發病率居男性惡性腫瘤首位，在我國其發病率逐年上升。重組人組織激肽釋放酶7基因(Kallikrein 7，KLK7)是人類組織激肽釋放酶基因家族的成員之一，編碼hK7蛋白。研究顯示該家族成員在多種惡性腫瘤組織中表達上升，可能為某些腫瘤的分子標記物［1］。本課題組前期研究發現，該基因在晚期前列腺癌組織中表達下降［2］。2012年3～9月，我們構建了高表達KLK7的前列腺癌穩定細胞株，旨在為KLK7在前列腺癌發生發展中作用的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種、細胞、質粒 TOP10感受態菌及pcDNA3.1克隆表達載體購自美國Invitrogen公司;人類前列腺癌細胞系DU145購自中國科學院生物細胞所細胞庫。構建重組載體所需反轉錄試劑盒、DNA聚合酶與限制性內切酶KpnⅠ購自TaKaRa公司;LipofectamineTM2000、Trizol Reagent及 SOC 培養基為美國Invitrogen公司產品;蛋白分子量Marker由賽百勝公司提供;PCR相關試劑為上海生物工程有限公司產品;細胞培養試劑購自Gibco公司;抗體購自Abcam公司。

1.2 人KLK7完整開放讀碼框(ORF)擴增 分離純化人正常前列腺組織上皮細胞，Trizol法提取總RNA，-80℃保存備用。反轉錄合成 cDNA，行PCR擴增。為提高蛋白的表達效率，引物中設計引入KOZAK系列。上游引物:5'-ACCATGGCAAGATC CCTTCTCC-3';下游引物:5'-TTAGCGATGCTTTTTCA TGGTGTC-3'。PCR 反應條件:95 ℃ 、5 min，1個循環;95 ℃、1 min，56 ℃、1 min，72 ℃ 、1 min，30個循環;最后72℃延伸10 min。擴增產物全長765 bp。產物于1.7% 瓊脂糖膠電泳，凝膠成像系統檢測。

1.3 真核表達載體構建 選擇真核 pcDNA3.1表達載體。將PCR產物電泳后切膠純化，T4 DNA連接酶將產物與pcDNA3.1表達載體進行連接。連接產物轉化至感受態大腸桿菌TOP10。應用Amp抗性的LB瓊脂平板培養基篩選陽性克隆，挑取白色菌落擴增培養，提取質粒。對重組質粒進行酶切鑒定，之后進行DNA測序。將測序得到的序列與NCBI公布的KLK7全長cDNA序列進行比對。

1.4 細胞轉染 將DU145細胞置于內含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液中，于飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞按2×105個/孔密度種于24孔板中，過夜培養使得次日細胞匯合度達到90%～95%，按陽離子脂質體載體(LipofectamineTM2000)操作說明進行轉染。24 h后棄去舊培養液，消化細胞接種于10 cm培養皿進行培養，700 μg/mL G418進行細胞篩選。設置空載體細胞作為對照。篩選出單克隆細胞后行擴大培養。

1.5 轉染細胞株KLK7表達測定 采用Western blot法。分別提取空載體轉染細胞和pcDNA3.1-KLK7轉染細胞的蛋白，定量，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后電轉到PVDF膜;5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，一抗(1∶1 000)4℃搖床孵育過夜;TBS洗膜后二抗(1∶3 000)室溫1 h;再次洗膜，化學發光，顯影，定影。

2 結果

2.1 pcDNA 3.1-KLK7載體結構 載體酶切鑒定抽提質粒，采用KpnI限制性內切酶進行酶切，載體結構如圖1。因 pcDNA3.1載體和KLK7開放讀碼框上各有一個酶切位點，該酶在插入方向正確的重組表達載體電泳顯示切下的條帶為686 bp，與預期相符，見圖2。對符合預期的重裝質粒DNA測序驗證，結果見圖3。

圖1 pcDNA3.1-KLK7結構及酶切位點位置示意圖

圖2 載體KpnⅠ限制性內切酶酶切電泳圖

圖3 陽性質粒DNA測序圖(部分)

2.2 轉染細胞株KLK7表達 蛋白免疫印跡結果表明，空載體組細胞無目的條帶，而轉染細胞有特異條帶，大小與文獻報道相符。說明轉染的DU145成功表達hK7蛋白;而對照細胞不表達hK7。見圖4。

圖4 轉染細胞及空載體細胞hK7表達比較

3 討論

KLK7編碼hK7蛋白;該家族分子結構保守，均表達絲氨酸蛋白酶活性;目前共發現有15個成員，按發現先后記為KLK1～KLK15，相應所編碼的蛋白為hK1～hK15［3］。hK7最早被發現在皮膚角質層高表達，因其具有糜蛋白酶樣活性，最先被命名為角質層糜蛋白酶(SCCE);hK7參與表皮脫屑相關的各種生理和病理過程，主要機制是降解角質層細胞間的橋粒等胞間連接結構從而造成細胞脫落。研究顯示這是一個有絲氨酸蛋白酶參與的蛋白水解過程［4，5］。

人體很多體液中有較高hK7表達，如卵巢癌腹水、乳汁、唾液、精液、血清、滑膜液、男性尿液等［1］。近年的一些研究結果顯示hK7與某些惡性腫瘤的發生發展有相關性，如 hK7 在卵巢癌［6］、胰腺癌［7］、結腸癌組織中表達上調［8］，而hK7在乳腺癌及前列腺癌組織中表達下調［9］;這些腫瘤有激素依賴性的，也有非激素依賴性的(多數KLKs表達受激素調控)。hK7已經被認為是卵巢癌及宮頸癌的潛在標志物［10，11］。在腦腫瘤中，hK7 也與腦瘤細胞的惡性程度成正相關［12］。關于hK7在腫瘤中如何發揮作用，有研究認為hK7可通過降解胞外基質，導致上皮細胞脫落及細胞結構松散，從而促進腫瘤細胞浸潤及轉移［10，13］。其他的體外研究發現，hK7剪切E-鈣黏素分子產生的可溶性片段可以促進胰腺腫瘤的轉移［14］。目前關于hK7在腫瘤發生發展中的確切作用模式尚不明確，較多學者認為其與惡性病變相關。

本課題組前期的研究顯示，前列腺癌組織中KLK7表達較癌旁及前列腺增生細胞低，其作用機制尚不清楚［15］。為深入研究其功能，包括其參與的信號通路、對細胞的影響等，需要構建高表達hK7蛋白的前列腺癌細胞株。本研究成功構建了KLK7的真核表達載體，并獲得一系列表達量不同的穩定細胞株，從中篩選出高表達株有助于進一步的研究。

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