壯骨止痛方全方提取物對去勢雌鼠骨保護素的影響＊

張國民，黃 娟，寧炯杰，李筠芝，莫新民，劉慧萍

(湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208)

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨組織微細結構破壞為特征，繼而導致骨脆性增加和骨折危險性增高的1種全身性骨骼疾病。我國原發(fā)性骨質疏松癥的發(fā)病率男性為60.72%，女性現(xiàn)已高達90.48%［1］。如何積極預防老年人特別是絕經(jīng)后婦女骨質疏松癥，提高人民生命質量，已成為當前亟待解決的課題。壯骨止痛方由補骨脂、淫羊藿、枸杞、牛膝等7味藥物組成，具有補腎氣、溫腎陽、兼顧滋補肝腎陰精、壯骨止痛的功效［2］。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只3月齡雌性SD大鼠，體質量250 g左右，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供(合格證號SCXK(粵)2008-0002)。

1.2 藥品及試劑

壯骨止痛方全方提取物由中南大學藥理學實驗室提供;E2放免試劑盒(批號HY-032)，北京華英生物技術研究所;一抗:OPG(批號BA1475)、SABC試劑盒(批號 SA1022)、DAB顯色試劑盒(批號AR1022)，均購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 主要儀器

r放射免疫計數(shù)器(GC-1500)、JY3002型電子天平、超低溫溫冰箱、LEICA DM LB2型雙目顯微鏡、HHS-2電子恒溫不銹鋼水浴鍋、Haier醫(yī)用微波爐、LKB-Ⅲ型超薄切片機、JEOL-1230型透射電鏡、MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)、Motic B5顯微攝像系統(tǒng)等。

2 方法

2.1 造模方法

適應性飼養(yǎng)1周，隨機分出空白組和假手術組各15只，除空白組外，其余均用2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g體質量)麻醉，在無菌條件下從距離大鼠第一胸腰椎外側1 cm處縱向切開皮膚及兩側肌肉，摘除雙側卵巢，假手術組僅在卵巢周圍切除相應重量的脂肪，分兩層縫合傷口并用生理鹽水擦洗干凈血跡，術后連續(xù)3 d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4萬 u/d，飼養(yǎng)于室溫 23～25℃、相對濕度50% ～70%的清潔環(huán)境中，自由攝食和攝水［3］。

2.2 動物分組

術后1周將模型大鼠隨機分為模型組、壯骨止痛方全方組，加上假手術組和空白組共4組，每組15只。

2.3 給藥方法

術后1周開始給藥，各組給藥劑量均嚴格按照臨床給藥劑量進行人鼠體表面積換算后，根據(jù)各藥的臨床給藥劑量的提取量進行確定，并且根據(jù)實際情況把藥物制備成油相和水相。給藥劑量為:油相0.4 mL/100 g體質量，水相0.6 mL/100 g體質量，為消除差異，水相加灌油中王牌的植物油，油相加灌冷的白開水，即各組油和水的每次給藥總劑量為1 mL/100 g體質量。模型組、空白組、假手術組只灌胃相應體積的植物油和冷開水。連續(xù)灌胃13周，每10 d稱1次體質量，13周之后按文獻要求處死動物，并取材檢測相關指標［2］。

2.4 檢測指標

連續(xù)灌胃13周，每10 d稱1次體質量，13周之后所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹部切口分離腹主動脈，用負壓采血管采血10 mL，離心后分離血清檢測雌二醇;取右側脛骨用5%的硝酸脫鈣1周，2.5%戊二醛固定24 h以上，超薄切片厚約500埃，電子染色，觀察骨組織的超微結構;取左側股骨，用4%的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脫鈣1周，石蠟包埋，用Shandon切片機間斷連續(xù)切片，切片厚4 um，采用SABC法檢測OPG在骨組織中的表達，染成棕黃色為陽性表達。每張免疫組化的切片選5個視野，參與計算機圖像分析。采用北航MIAS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，在40倍物鏡下行陽性面積計數(shù)，平均面密度測定。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較方差齊時用方差分析，方差不齊時用軼和檢驗。

3 結果與分析

3.1 對去勢雌性骨質疏松癥大鼠血清E2影響

表1 各組對雌鼠血清E2的影響(±s)

注:與模型組比較:▲P＜0.05;▲▲P＜0.01

組別 例數(shù) E2(pg/ml)15 2.82±0.10全 方 提 取 組 15 5.81±1.12▲空 白 對 照 組 15 4.00±0.36▲假 手 術 組 15 4.03±0.30模型組▲▲

與模型組比較，各組都能明顯升高大鼠血清E2含量(P＜0.05)。

3.2 對去勢骨質疏松癥模型雌鼠右脛骨骨細胞超微結構的影響

圖1～5顯示，模型組大部分骨細胞胞核及胞漿濃縮明顯，骨細胞突起明顯減少，骨陷窩橢圓形;壯骨止痛方組骨細胞較正常，骨細胞突起無明顯改變，骨陷窩明顯縮小呈扁橢圓形;假手術組骨間質致密，骨細胞內(nèi)部分線粒體存在空泡變性，骨陷窩較小;空白組骨細胞線粒體無變性，骨細胞突起無改變，骨陷窩較小。

3.3 OPG的表達

表2顯示，采用免疫組織化學檢測OPG。結果判斷，陽性細胞的細胞膜和胞漿被染成棕黃色(見圖6～10)，與陰性細胞形成鮮明對比。切片于光鏡下400倍放大，經(jīng)顯微攝像系統(tǒng)隨機攝取5個視野，通過圖像分析系統(tǒng)檢測每個視野內(nèi)陽性染色細胞面密度并取其平均值。所得數(shù)據(jù)用方差分析進行統(tǒng)計處理。

表2 各組大鼠股骨組織OPG表達的平均面密度表達比較(±s)

表2 各組大鼠股骨組織OPG表達的平均面密度表達比較(±s)

注:與模型組比較:★P＜0.01

組別 例數(shù)OPG模 型 組15 10.32±1.01全 方 提 取 組 15 19.82±1.98★空 白 對 照 組 15 17.24±2.11★假 手 術 組 15 17.59±2.16★

與模型組比較，壯骨止痛方組能夠顯著增加大鼠OPG的平均面密度(P＜0.05)。

圖6 ～10 OPG免疫組化染色

4 討論

骨組織是雌激素的靶器官之一，這一觀點正由日漸增多的研究所證實，雌激素對于維護骨吸收及骨形成的平衡至關重要［4］。實驗證明，補腎中藥能夠增加成骨細胞上雌激素受體(ER)，具有雌激素樣作用，針對腎虛實質使下丘腦-垂體-性腺之間保持動態(tài)平衡，這也是補腎中藥治療骨質疏松癥的可能機制之一。壯骨止痛方組方中補骨脂、枸杞等藥物都具有雌激素樣作用［5］。正常情況下，破骨細胞形成刺激因子OPGL及抑制因子OPG的表達是平衡的，破骨細胞的分化發(fā)育和激活受到巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)、骨保護蛋白 (OPG)和骨保護蛋白配體(OPGL)3種信號分子的調節(jié)［6］，使骨形成和骨吸收維持平衡狀態(tài)。因而，OPG和OPGL構成了直接影響破骨細胞分化及其功能、調節(jié)骨再建的細胞調控網(wǎng)絡，也是其他許多細胞因子介導破骨細胞和骨吸收的最終和共有通路。現(xiàn)有研究表明，OPG基因敲除的小鼠表現(xiàn)嚴重骨質疏松，轉OPG基因小鼠可引起骨骼彌漫性硬化［7］，表明OPG對骨密度具有重要調節(jié)作用。本實驗模型組OPG較空白對照組下降，差異有統(tǒng)計學意義。

通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，壯骨止痛方全方提取物能改善去勢骨質疏松模型大鼠機體激素代謝紊亂，增加雌二醇含量，提高OPG含量而起到抗骨質疏松的作用;可顯著增加去勢雌鼠左股骨骨小梁密度和左股骨頸梁髓比，改善脛骨骨組織超微結構，從而改善骨基質的分子結構，加強骨生物力學性能。

［1］朱建民，程秦娣.絕經(jīng)后骨質疏松癥［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2006，12(4):234-236.

［2］張國民，莫新民.壯骨止痛方全方提取物對去勢雌鼠基質金屬蛋白酶2的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2010，16(11):1010-1012.

［3］朱蕾，趙小英，盧興國.去卵巢大鼠骨密度變化與骨髓組織血管生成的關系［J］.中國病理生理雜志，2009，25(9):1801-1805.

［4］Tmuer，C.H.，Sato，M.，nadByrnad，H.U.Raloxiefne Presevres bone srength and bone mass in ovariectiomized rats［J］.Endocrinology，1994a，135:2001-2005.

［5］曾英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對去卵巢雌鼠骨質疏松癥骨強度和生物力學的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(4):292-295.

［6］Turner RT，Wakley GK，Hannon KS，et al.Tamoxifen inhibits osteoclast mediated resorption of trabecular bone in ovarian hormone delicient rats［J］.Endocrinology，1988，112:1146.

［7］Wronski TJ，Cintron M，Doherty AL，et al:Estrogen treatment prevents osteopenia and depresses bone turnover in ovariectomied rats［J］.Endoerinology，1988，123:618.