益氣通絡(luò)方對慢性缺血性腎病早期大鼠AngⅡ、α-SMA表達的影響＊

李 偉，劉蘭英，李嬌艷，李根茂，葛東宇

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心，北京 100029)

慢性缺血性腎病(chronic ischaemic renal disease，CIRD)是指因腎動脈狹窄(renal artery stenosis，RAS)或阻塞≥60%，引起腎血流動力學(xué)顯著改變，從而導(dǎo)致腎小球濾過率下降、腎功能不全的1種慢性腎臟疾病［1］，是中老年人(年齡≥50歲)發(fā)生終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因之一［2］。臨床上，我們通過益氣通絡(luò)法治療慢性缺血性腎病早期病變?nèi)〉昧溯^好療效。因此本實驗擬通過觀察益氣通絡(luò)方對慢性缺血性腎病早期大鼠腎組織AngⅡ、α-SMA表達的影響，以探討其防治慢性缺血性腎病早期病變可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雄性大鼠60只，190～210 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(許可證號SCXK(京)2012-0001)。

1.2 藥物

益氣通絡(luò)方組成:黃芪10 g，黨參10 g，當(dāng)歸10 g，桂枝 10 g，川芎 10 g，赤芍 10 g，全蝎 6 g，地龍 6 g，熟大黃6 g，白花蛇舌草10 g，炙甘草5 g，為康仁堂制藥廠生產(chǎn)的配方顆粒。

1.3 試劑

AngⅡ抗體:北京博奧森生物技術(shù)有限公司(貨號bs-0587R);α-SMA抗體:武漢博士德生物工程有限公司(貨號BM0002);兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號PV-9001);小鼠超敏二步法免疫組化檢測試劑盒:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(貨號PV-9002)。

1.4 儀器

光學(xué)顯微鏡:奧林巴斯公司(型號L340099);顯微照相機:OLYMPUS。

1.5 方法

1.5.1 SD雄性大鼠慢性缺血性腎病模型復(fù)制方法 將模型組和各藥物組的大鼠用10%的水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，打開腹腔，分離出雙側(cè)腎動脈，把直徑為0.30 mm的針灸針與腎動脈血管長軸緊貼平行放置，用1號手術(shù)縫線將腎動脈和針灸針一起扎緊，然后抽出針灸針，關(guān)閉手術(shù)切口。假手術(shù)組除不放置針灸針和不用手術(shù)縫線緊扎外，其余手術(shù)操作均同上。

1.5.2 分組及給藥 將60只SD雄性大鼠隨機分為4組，每組各15只，隨機分為假手術(shù)組(術(shù)后次日灌胃生理鹽水3 ml/只，每日1次)、模型組(術(shù)后次日灌胃生理鹽水3 ml/只，每日1次)、預(yù)防組(術(shù)前3 d灌胃益氣通絡(luò)方10.85 g/kg/d，每日1次)、藥物組(術(shù)后次日灌胃益氣通絡(luò)方10.85 g/kg/d，每日1 次)。

1.5.3 取材及觀察指標(biāo) 術(shù)后14 d處死大鼠，迅速取其雙側(cè)腎臟，一部分放入4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片行腎臟免疫組化。免疫組化圖像根據(jù)染色的深淺(光密度)及分布面積來確定目標(biāo)蛋白量。采用Image-Pro P1us 6.0專業(yè)圖像分析軟件對圖像進行分析，每張切片隨機取至少5個視野，比較各組平均光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用LSD法，各種檢驗的顯著性水平設(shè)定為P＜0.01。

圖1 各組大鼠腎組織AngⅡ免疫組化實驗結(jié)果(×200)

2 結(jié)果

表1、圖1、2顯示，與正常組比較，模型組的AngⅡ、α-SMA表達均明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，藥物組及預(yù)防組AngⅡ、α-SMA表達均明顯降低(P＜0.01);預(yù)防組與藥物組比較，AngⅡ、α-SMA表達明顯降低(P＜0.01)。

表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各組表達的光密度分析(±s)

表1 ICAM-1、AngⅡ、α-SMA 在各組表達的光密度分析(±s)

注:與正常組比較:△P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.01

組 別 例數(shù) AngⅡ α-SMA假手術(shù)組0.000 0.000 15 70.55±1.69 69.95±0.81模 型 組 15 132.61±1.57△ 105.66±0.91△藥 物 組 15 109.70±1.59* 90.93±0.97*預(yù) 防 組 15 89.83±1.47* 76.21±1.07*F 283.490 286.124 P

圖2 各組大鼠腎組織AngⅡ免疫組化實驗結(jié)果(×200)

3 討論

腎動脈狹窄時，腎內(nèi) RAS系統(tǒng)被激活，局部RAS系統(tǒng)被激活，有可能與慢性缺血性腎病腎間質(zhì)纖維化有關(guān)。在RAS系統(tǒng)中，AngⅡ被認為是發(fā)揮作用的最主要因子［5］，它可以促進血管收縮，導(dǎo)致腎臟血流量減少，并與局部浸潤活化的巨噬細胞共同參與腎臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟纖維化的進展。大量研究顯示，慢性缺血性腎損害可以作為腎間質(zhì)纖維化的1個獨立影響因素，Myo-FB又在腎缺血導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化中起重要作用，它可以分泌膠原纖維連接蛋白，促使ECM的聚集，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。α–SMA是Myo-FB的標(biāo)志性蛋白，在腎間質(zhì)纖維化的早期即可出現(xiàn)，可作為慢性缺血性腎病腎間質(zhì)纖維化的早期評判指標(biāo)［6～8］。

楊步軍［9］認為，本病多因先天不足，后天失養(yǎng)，以致脈道受損、經(jīng)絡(luò)阻塞、氣血運行不暢、氣滯血瘀而成。吳以嶺絡(luò)病理論［10］認為，腎動脈不全結(jié)扎致腎動脈狹窄慢性缺血性腎損傷的中醫(yī)病機為腎絡(luò)損傷導(dǎo)致腎絡(luò)絀急(血管痙攣)，進而腎絡(luò)郁滯、腎絡(luò)瘀阻甚至腎絡(luò)瘀塞，針對病變早期營衛(wèi)不通、腎絡(luò)郁滯病機，治療應(yīng)以益氣通絡(luò)為主，方以益氣通絡(luò)方，黃芪、黨參、當(dāng)歸益氣補血，活血通絡(luò)，“血中氣藥”川芎行營氣助血運，合桂枝有調(diào)和營衛(wèi)之義，全蝎、地龍搜風(fēng)通絡(luò)，熟大黃、白花蛇舌草解毒通絡(luò)，赤芍活血通絡(luò)，合甘草緩攣急，合桂枝、甘草亦有調(diào)和營衛(wèi)之義。

本課題意圖揭示益氣通絡(luò)方防治慢性缺血性腎病的機制，結(jié)果表明益氣通絡(luò)方可能是通過降低AngⅡ、α-SMA的表達干預(yù)慢性缺血性腎病的發(fā)生發(fā)展。

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［2］柳昔傲.缺血性腎病診治研究進展［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2006，27(2):166-167.

［3］賀巍，陳威，劉彥仿，等.實驗性慢性腎缺血中腎小管-間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的規(guī)律及意義［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2003，24(4):286-288.

［4］陳威，楊守京，劉彥仿，等.實驗性慢性腎缺血模型腎小管-間質(zhì)細胞α-平滑肌肌動蛋白的表達和意義［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2004，13(1):30-34.

［5］郭登洲，王月華，邊東，等.活血化瘀消癥通絡(luò)中藥對糖尿病腎病大鼠血管緊張素系統(tǒng)的影響［J］.中醫(yī)雜志，2010，51(1):75-78.

［6］陳威，楊守京，劉彥仿，等.實驗性慢性腎缺血模型腎小管-間質(zhì)細胞 α-平滑肌肌動蛋白的表達和意義［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2004，13(1):30-34.

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［8］賀巍，陳威，劉彥仿，等.實驗性慢性腎缺血中腎小管-間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化的規(guī)律及意義［J］.西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2003，24(4):286-288.

［9］楊步軍，郝占峰，張建軍，等.中西醫(yī)結(jié)合治療大動脈炎腎性高血壓療效觀察［J］.中醫(yī)雜志，2010，51(1):162-163.

［10］吳以嶺.脈絡(luò)論［M］.北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社，2010:11，184-186.