六味地黃湯對慢性腎衰大鼠腎小管上皮細胞EMT的影響＊

陳 麗，張 熙，周忠志，何澤云△，唐 群，徐文峰

(1.湖南中醫藥大學病理教研室，長沙 410208;2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是目前不容忽視的重大疾病之一［1］。腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟病向終末期腎病進展的重要過程，是CRF的主要病理 改 變［2］。 上 皮-間 充 質 轉 分 化 (epithelialmesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞分化為間充質細胞［3］。目前研究證實，腎小管上皮細胞EMT是RIF形成的關鍵環節［4］，腎小管上皮細胞可通過 EMT轉分化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MF)，MF可分泌大量的膠原，導致腎臟結構重塑，同時MF也分泌TIMP，使ECM增加而降解減少，促進腎臟纖維化［5］。六味地黃湯是目前臨床運用治療慢性腎臟病的有效方劑［6］，六味地黃湯減輕RIF也有廣泛的實驗研究，我們前期對六味地黃湯和CRF致RIF做了大量的研究［7～10］，但以往未從 EMT角度對六味地黃湯減緩RIF機理進行深層次研究。

本研究以5/6腎切除CRF大鼠模型為平臺，用免疫組化、Western Blot、RT-PCR技術檢測腎小管上皮細胞標志物E-cadherin、肌成纖維細胞標志物α-SMA、FSP-1的表達水平，觀察大鼠5/6腎切除致CRF腎間質纖維化中的EMT現象，探討腎RIF的發生機理和六味地黃湯的干預機理，為六味地黃湯的臨床療效提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠60只，體質量180±20 g，由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 六味地黃湯(熟地黃24 g(河南)、山茱萸12 g(湖南)、山藥12 g(河南)、牡丹皮9 g(安徽)、澤瀉9 g(湖南)、茯苓9 g(湖南))中的中藥材均一次性購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科。先將藥材用相當于藥材5倍的自來水浸泡2 h煮沸后再微火煎熬30 min，過濾后收集煎液，原藥渣加少量水煎煮，取二煎液。將兩煎液混合，于水浴恒溫器上濃縮至含生藥1 g/ml，高壓滅菌、分裝，4℃保存備用。

1.1.3 主要試劑 兔抗大鼠E-cadherin(120kDa)試劑盒、兔抗大鼠 α-SMA(42kDa)試劑盒、兔抗大鼠 FSP-1(64kDa)試劑盒:Bloassay Technology Laboratory;十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸胺(AP):北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;瓊脂糖、甲雙丙烯酰胺 (Bic)、二硫蘇糖醇 (DTT)、TEMED(1568A14)、Phosphatase Inhibitor Cocktail 2:Sigma-Alorich;Trizol:美國MRC公司;RT試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs:美國Fermentas公司;逆轉錄試劑盒和GoTaq Green Master Mix:Promega公司;100 bp DNA Ladder:北京鼎國生物技術發展中心。

RT-PCR引物列表

1.1.4 主要儀器 Motic BA410T生物顯微鏡、Moticam Pro 285A CCD IMAGING SUOLUTION、Motic Medical 6.0數碼顯微圖像分析系統軟件:德國;MultiphorII Nova Blot:pharmacia Biotech;PROTEAN II Xi Cell:BIO-RAD;721B型分光光度計:上海第三分析儀器廠;鼎國py-120水平脫色搖床，北京鼎國生物技術有限責任公司;UMAX掃描儀:臺灣;PCR儀(2400型):美國PERKIN ELMER公司;紫外分光核酸蛋白蛋白分析儀:美國Beckman公司;電泳凝膠圖像分析儀:上海Tanon公司;電泳轉膜儀(TE 52X-230V):美國Hoefer公司。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 (1)造模:按照文獻［11］報道方法造模。(2)分組:SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組、假手術組、手術組，手術組術前禁食，均在無菌條件下進行5/6腎切除術，六味組給予以六味地黃湯灌胃(生藥含量按公式:人的劑量×0.018×5/kg體質量計算)，每天1次，至處死為止;模型組、假手術組和正常組以等容積蒸餾水灌胃，各組每天灌胃1次，給藥8周后所有動物一次性處死。(3)免疫組化步驟:4 μm石蠟切片，切片后經過如下程序處理:①常規處理石蠟切片;②滴加適量試劑A:內源性過氧化酶封閉液(約50 ul)，37℃孵育20 min、PBS洗5 min×3次;③滴加適量試劑B:封閉用正常山羊血清工作液(約50 ul)，37℃孵育20 min、甩干;④滴加適量一抗工作液(約50 ul)稀釋度分別是 E-cadherin(1∶200)、α-SMA(1∶300)、FSP-1(1∶700)，切片置于免疫組化保濕盒37℃ 2 h、PBS洗5 min×3次;⑤滴加適量試劑C:生物素標記二抗工作液(約50 ul)，37℃孵育15 min、PBS洗5 min×3次;⑥滴加適量試劑D:HRP標記鏈霉親和素(約50 ul)，37℃孵育15 min、PBS洗5 min×3次;⑦DAB顯色(室溫，鏡下控制反應時間);⑧終止顯色:用蒸餾水終止顯色反應;⑨蘇木素輕度復染、脫水透明、封片。(4)Western Blot步驟:實驗前先配好裂解液、G-250考馬斯亮藍溶液、12%分離膠和5%濃縮膠、上樣緩沖液、電泳液緩沖液、轉膜緩沖液、TBS緩沖液、TBST緩沖液、封閉液。①總蛋白的樣品制備;②蛋白含量的測定:制作標準曲線、檢測樣品蛋白含量;③SDS-PAGE電泳:清洗玻璃板、灌膠與上樣、電泳;④轉膜;⑤免疫反應;⑥化學發光、顯影、定影;⑦凝膠圖像分析。(5)RTPCR步驟:①約100 mg重的腎臟置于研缽中，并加入少量液氮及0.1 mlTrizol，仔細研磨、混勻;迅速移入1.5 mlEP離心管(先已加入0.9 mlTrizol)，在漩渦混合器上劇烈震蕩30 s，完全混勻，冰上靜置5 min;②加入200 μl氯仿混勻，室溫使之分層。13000 rpm離心5 min;小心將上層水相轉移到無菌RNase-free的1.5 ml eppendorf管中;③加入一半體積的RNA沉淀試劑和異丙醇混勻，室溫放置5 min，13000 rpm離心5 min;④小心去除上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀，13000 rpm離心5 min;⑤小心去除上清，離心數秒吸去殘余液體，60℃烤箱內放置5 min去除乙醇;⑥適當體積RNase-free H2O溶解，60℃烤箱內放置5 min使其溶解充分;⑦電泳觀察抽提效果和估計含量;⑧約1 ug的總RNA進行逆轉錄;⑨PCR反應，總體系15 ul，94℃變性5 min，循環采用94℃變性0.5 min，56℃退火 0.5 min，72 ℃ 延伸0.5 min，35 個循環后，72 ℃延伸10 min，4℃存放;⑩電泳分析:凝膠成像系統中觀察并拍照。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 免疫組化染色結果與分析

表1顯示，E-cadherin的表達:正常組腎小球腎間質均無表達，腎近曲小管胞漿管腔面、腎遠曲小管漿、核內均有大量棕黃色物質沉積，著色深且著色面積大，表達量明顯(圖1)，假手術組與正常組比較，表達量無顯著差別(圖2)，面密度值及平均灰度值差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，腎小球內無表達、部分被膜纖維、腎近曲小管細胞胞漿、腎遠曲小管胞漿、核內少量表達，腎間質內可見棕黃色物質沉積，著色深且著色面積大，表達量顯著增多(圖3)，面密度值降低，平均灰度值增加，2組比較差異均有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較，腎近曲小管、腎遠曲小管胞漿有棕黃色物質增多，著色加深且著色面積增大，表達量顯著增多(圖4)，面密度值增大，平均灰度值減少，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

表2顯示，α-SMA的表達:正常組腎小球、腎小管均無α-SMA蛋白表達(圖5);假手術組與正常組比較，α-SMA蛋白的表達量無顯著差別(圖6)，面密度值及平均灰度值差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，被膜纖維、腎小球、腎小管上皮細胞胞漿、腎間質內均有大量棕黃色物質沉積，著色深且著色面積大，α-SMA蛋白的表達量顯著增多(圖7)，面密度值增加，平均灰度值降低，2組比較差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較，被膜纖維、腎小球、腎小管上皮細胞胞漿、腎間質內棕黃色物質減少，著色變淺且著色面積變小，α-SMA蛋白的表達量減少(圖8)，面密度值減少，平均灰度值增大，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

注:以上圖片均為免疫組化染色，放大倍數為10 ×40。圖1、5、9 為正常組，圖2、6、10 為假手術組，圖3、7、11 為模型組，圖4、8、12 為六味組

表1 E-cadherin面密度值及平均灰度值定量分析(±s)

表1 E-cadherin面密度值及平均灰度值定量分析(±s)

注:與正常組比較:▲P＜0.01;與假手術組比較:●P＜0.01;與模型組比較:★P＜0.01

組 別 例數 面密度值(‰)平均灰度值正 常 組10 118.62±35.03 100.70±11.36假手術組 10 114.06±34.26 103.73±12.64模 型 組 14 16.74± 3.87▲● 157.70±11.65▲●六 味 組 17 69.28±23.89▲●★ 120.04±11.71▲●★

表2 α-SMA面密度值及平均灰度值定量分析(±s)

表2 α-SMA面密度值及平均灰度值定量分析(±s)

注:與正常組比較:▲P＜0.01;與假手術組比較:●P＜0.01;與模型組比較:★P＜0.01

組 別 例數 面密度值(‰)平均灰度值正 常 組10 0.65±0.03 152.20±25.41假手術組 10 1.54±0.05 151.60±28.34模 型 組 14 39.64±1.21▲● 80.60±20.57▲●六 味 組 17 6.05±0.19▲●★ 129.80±21.13▲●★

表3顯示，FSP-1的表達:正常組腎小球、腎小管均無FSP-1蛋白表達(圖9);假手術組與正常組比較，FSP-1蛋白的表達量無顯著差別(圖10)，面密度值及平均灰度值差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，被膜纖維、腎小球、腎小管上皮細胞胞漿、腎間質內均有大量棕黃色物質沉積，著色深且著色面積大，FSP-1蛋白的表達量顯著增多(圖11)，面密度值增加，平均灰度值降低，2組比較差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較，腎小球、腎小管上皮細胞胞漿、腎間質內棕黃色物質減少，著色變淺且著色面積變小，FSP-1蛋白的表達量減少(圖12)，面密度值減少，平均灰度值增大，差異均有統計學意義(P＜0.01)。

表3 FSP-1面密度值及平均灰度值的定量分析(±s)

表3 FSP-1面密度值及平均灰度值的定量分析(±s)

注:與正常組比較:▲P＜0.01;與假手術組比較:●P＜0.01;與模型組比較:★P＜0.01

組 別 例數 面密度值(‰)平均灰度值正 常 組10 2.69±0.33 171.30±21.91假手術組 10 3.58±0.48 168.56±22.21模 型 組 14 88.93±3.14▲● 91.90±10.77▲●六 味 組 17 26.69±1.57▲●★ 143.42±22.18▲●★

2.2 Western Blot免疫印跡結果與分析

2.2.1 E-cadherin免疫印跡結果與分析 本實驗結果顯示，正常組表達水平高，假手術組與正常組比較，E-cadherin蛋白的表達量差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，表達量明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量增高，差異有統計學意義(P＜0.01)(見圖 13)。以 β-actin蛋白作為內參，計算 E-cadherin/β-actin比值并進行統計分析(表4)。

2.2.2 α-SMA免疫印跡結果與分析 圖14表4顯示，正常組表達水平低，假手術組與正常組比較，α-SMA蛋白的表達量無顯著差別，差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。以 β-actin蛋白作為內參，計算 α-SMA/βactin比值并進行統計分析。

2.2.3 FSP-1免疫印跡結果與分析 圖15表4顯示，正常組表達水平低，假手術組與正常組比較，FSP-1蛋白表達量無顯著差別，差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。以 β-actin蛋白作為內參，計算 FSP-1/βactin比值并進行統計分析。

表4 E-cadherin、α-SMA、FSP-1 蛋白表達水平比較(±s)

表4 E-cadherin、α-SMA、FSP-1 蛋白表達水平比較(±s)

注:與假手術組比較:▲P＜0.01;與模型組比較:●P＜0.01

組別-actin正 常 組 10 5.8703±0.0014 0.1080±0.0021 2.0235±0.00例數 E-cadherin/β-actin α-SMA/β-actin FSP-1/β 34假 手 術 組 10 5.8821±0.0115 0.1381±0.0044 2.0140±0.0028模 型 組 14 0.8274±0.0026▲ 11.8257±0.0052● 7.1556±0.0043▲六 味 組 17 4.2986±0.0033▲● 4.9631±0.0037●★ 4.5765±0.0052▲●

2.3 RT-PCR結果與分析

2.3.1 E-cadherin結果與分析 圖16、表5顯示，正常組表達水平高，假手術組與正常組比較，E-cadhenrin的mRNA表達量差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較，表達量明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量增高，差異有統計學意義(P＜0.01)。以β-actin蛋白作為內參，計算E-cadherin/β-actin比值并進行統計分析。

表5 E-cadherin、α-SMA、FSP-1 mRNA 表達水平比較(±s)

表5 E-cadherin、α-SMA、FSP-1 mRNA 表達水平比較(±s)

注:與假手術組比較:▲P＜0.01;與模型組比較:●P＜0.01

組別-actin正 常 組 10 1.5024±0.0052 0.3191±0.0018 0.5402±0.00例數 E-cadherin/β-actin a-SMA/β-actin FSP-1/β 33假 手 術 組 10 1.4967±0.0029 0.3187±0.0044 0.5396±0.0019模 型 組 14 0.5346±0.0037▲ 0.8710±0.0026▲ 1.4261±0.0053▲六 味 組 17 0.6787±0.0046▲● 0.7142±0.0035▲● 1.1504±0.0061▲●

注:1.正常組;2.假手術組;3.模型組;4.六味組(圖14～18同)

2.3.2 α-SMA結果與分析 圖17表5顯示，正常組表達水平低，假手術組與正常組比較，α-SMA的mRNA表達量差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。以β-actin蛋白作為內參，計算a-SMA/β-actin比值并進行統計分析。

2.3.3 FSP-1結果與分析 圖18、表5顯示，正常組表達水平低，假手術組與正常組比較，FSP-1的mRNA表達量差異無統計學意義(P＞0.05);模型組與假手術組比較表達量明顯增高，差異有統計學意義(P＜0.01);六味組與模型組比較表達量降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。以β-actin蛋白作為內參，計算 FSP-1/β-actin比值并進行統計分析。

3 討論

目前認為腎間質纖維化的發展過程主要分為4個階段，第一階段是細胞的活化和損傷，第二階段是纖維化相關因子的釋放，第三階段是纖維化的形成，第四階段是腎臟結構和功能的損傷。

腎小管EMT是腎間質纖維化發展過程的第一階段，是腎臟纖維化形成的關鍵環節［3，4］。EMT 的可能機制如下:①某些間充質細胞決定基因的激活:在病理條件下，某些間充質細胞決定基因如FSP-1基因的激活，而上皮細胞基因如E-鈣黏素(E-cadherin)基因、細胞角化蛋白(Cytokerin)基因關閉，不表達上皮細胞標志物，轉而表達間充質細胞標志物，發生上皮細胞轉分化;②某些細胞因子及代謝產物參與上皮細胞轉分化的發生，并可能是上皮細胞轉分化發生的重要機制;③基質膠原成分影響上皮細胞轉分化的發生［12］。Yang等將 EMT高度概括為4個主要步驟:一是失去上皮細胞黏附特性;二是a-SMA重新表達和肌動蛋白重組;三是基底膜破壞;四是細胞遷移和侵襲。1995年STRUTZ等發現，腎小管上皮細胞可表達成纖維細胞特異蛋白1(fibroblast-specific protein-1，FSP-1)，而這種蛋白通常只在成纖維細胞中表達，正常上皮細胞不表達，于是他們提出了EMT假說。隨后在體外實驗中后觀察到這種現象。Zhaoyu Lu等利用大鼠5/6腎切除后12周血清能使HK-2細胞轉分化成肌成纖維細胞［13］。在腎病患者腎活檢的標本中亦觀察到EMT現象［14］。在病理狀態下，腎小管上皮細胞具有向間充質細胞轉化的能力［15］，可通過EMT轉分化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MF)，MF既保留了成纖維細胞分泌膠原的能力，又與平滑肌細胞一樣能表達 a-平滑肌肌動蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)［16］。病理情況下，MF 分泌的膠原量是成纖維細胞的4、5倍，具有強大的收縮能力，導致腎臟結構重塑，促進腎纖維化。

以上研究表明，EMT是RIF的起始環節，為證實在動物體內RIF的第一階段存在EMT現象，我們以5/6腎切除慢性衰竭大鼠模型為平臺，分別用免疫組化、Western Blot、RT-PCR技術檢測腎小管上皮細胞標志物 E-cadherin、肌成纖維細胞標志物 α-SMA、FSP-1的表達水平，觀察大鼠5/6腎切除致慢性腎衰竭RIF中的EMT現象，本研究結果:與正常組、假手術組比，模型組在蛋白水平和mRNA水平，E-cadherin表達量明顯下調，α-SMA、FSP-1表達量均明顯上調，以上組間的差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01)，3種方法檢測結果一致，表明在5/6腎切除慢性衰竭大鼠RIF纖維化過程出現EMT現象，我們的實驗結果與相關文獻一致［17］。

六味地黃湯主治腎陰虛證，本方功效為滋陰補腎。熟地黃滋陰補腎，填精益髓、壯水之主，為君藥;山萸肉溫補肝腎，并能澀精;山藥補脾陰，兼能固精縮尿，兩者共為臣藥。三藥相配伍，滋養肝脾腎，用以治本。其中，肝腎同源，養肝陰即能補腎陰;脾主運化，滋脾陰即能益腎陰，故山萸肉、山藥共助熟地黃滋補腎陰。但此三藥補而滯膩，并因陰虛常能致虛火上炎，故用澤瀉瀉腎火、利濕泄濁，以防熟地黃之膩;丹皮瀉肝火，以除山萸肉溫斂肝陰之滯;茯苓能淡滲利濕，以除山藥滋脾之壅。六藥合用，三補三瀉，補而不滯，瀉而不傷，以補為主，以瀉為輔，形成甘淡平和、不溫不燥的平補之劑。六味地黃湯是目前臨床運用廣泛的治療慢性腎臟病的方劑。現代常用本方治療慢性腎炎、高血壓、糖尿病等病具有肝腎陰虛證候者。如在慢性腎炎、慢性腎功能衰竭、糖尿病腎病、狼瘡性腎炎、高血壓患者腎功能保護等疾病治療方面都取得了一定的療效。

我們長期對慢性腎衰腎間質纖維化機制及六味地黃湯的作用機理做了大量的研究。既往研究表明，六味地黃湯可減輕和抑制腎間質纖維化［7～10］，但未從EMT角度對六味地黃湯治療機理進行研究。本實驗從EMT角度，深入闡明六味地黃湯對慢性腎衰竭腎間質纖維化的作用機制，分別采用免疫組化、Western Blot、RT-PCR技術，檢測大鼠5/6腎切除經六味地黃湯治療8周后，E-cadherin、α-SMA、FSP-1表達水平的變化。結果顯示，與模型組比較，在蛋白水平和mRNA水平，六味組中E-cadherin表達量均明顯上調，α-SMA和FSP-1表達量均明顯下調，3種方法檢測具有一致性，以上組間的差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01)，此結果表明5/6腎切除，經六味地黃湯治療8周后，大鼠留存腎中EMT現象減輕，六味地黃湯可抑制EMT現象。

以上研究證實大鼠5/6腎切除致CRF模型留存腎中存在EMT現象，六味地黃湯可抑制EMT。

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