溫陽解郁法對母嬰分離小鼠行＊為模式及HPA軸功能的影響

岳廣欣，張 玲，盧賀起，梁 媛，劉麗梅，王瑞海，張立石，王 震

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

情感失調性疾病在我國發病率達11.7%［1］，童年期虐待和缺乏關懷等早年不良經歷成為引起情感失調性疾病的重要危險因素［2］。臨床調查顯示，兒童受虐類型、數量、嚴重程度、發生頻度和持續時間與成人抑郁癥的發生呈正相關［3］，但早年不良經歷所造成的創傷從童年持續到成年的具體機制尚不清楚。中醫理論認為，肝氣郁滯是抑郁癥的主要病機，解郁名方逍遙散治療抑郁癥得到廣泛關注和深入研究［4］。近年來，用溫陽補腎法治療抑郁癥的報道［5，6］逐漸增多，而早年不良經歷創傷的持續存在可能與腎精受損、陽氣不足有關，因此課題組運用溫陽解郁法進行了治療和預防抑郁癥的研究。已發表論文顯示，逍遙散加二仙湯主藥及活血化痰藥物對母嬰分離后遭受社會擊敗二次應激的抑郁癥模型小鼠有很好治療療效［7］，提示溫陽解郁方可改善與抑郁癥發病相關的病理機制，對早年經歷所致的行為及精神異常有潛在的治療作用。本文從該研究中關于預防實驗部分的結果探討溫陽解郁法對母嬰分離小鼠的作用機制，為預防早年不良經歷相關的病證提供線索。

1 材料與方法

1.1 母嬰分離［7］

選用大于12周的C57BL/6J雌鼠按雌雄=4∶1雌雄混居。孕鼠待產前轉為單籠飼養，分娩后以小鼠出生作為0天(P0)，分別于P 1～P 10進行母嬰分離，每天3 h。對照組幼鼠每天也按上述過程處理，分離時間小于10 min。

1.2 分組及處理

選用12～20周、體質量24～30 g的C57BL/6J雄性小鼠進入實驗。先將經過母嬰分離的小鼠分為母嬰分離模型組(模型組)、溫陽解郁組和氟西汀組，再將體質量及月齡相當、未經過母嬰分離的小鼠作為對照組。行為學檢測每組12只(決擇反應實驗需剔除失敗小鼠，故每組少于12只)，血清皮質酮(corticosterone，CORT)檢測每組20只，免疫組織化學檢測每組5只。溫陽解郁組和氟西汀組小鼠從實驗第1天起分別灌服溫陽解郁復方混懸液(5.25 g/kg)和氟西汀混懸液(20 mg/kg)，對照組和模型組小鼠灌服蒸餾水，共治療4周。

1.3 中藥及試劑

溫陽解郁復方與治療用溫陽解郁方(XSF)相比減去活血化痰類藥物，其方劑組成為柴胡、白芍、當歸、白術、茯苓、仙茅、淫羊藿、郁金、連翹各15 g，炙甘草7.5 g，薄荷2 g。中藥飲片均購自同仁堂飲片有限公司，常規煎煮水提，低溫真空干燥成干浸膏并粉碎，使用時將中藥浸膏粉末按比例混于蒸餾水中備用。氟西汀膠囊為禮來公司生產，地塞米松注射劑由四川迪康藥業公司生產，促腎上腺素釋放激素(CRH)為Sigma公司產品，小鼠CORT放射免疫檢測試劑盒為美國DSL公司產品，糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)抗體(M-20)為Santa Cruz公司產品，綿羊來源11β-羥 基 類 固 醇 脫 氫 酶 2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD2)抗體為 Chemicon 公司產品，Elite ABC試劑盒及生物素化的免抗綿羊抗體均為Vector產品，行為分析軟件Ethovision3.0為荷蘭Noldus公司產品。

1.4 行為學檢測

行為學檢測均在治療4周后開始，具體如下。

1.4.1 曠場實驗 將小鼠輕輕放入曠場箱(40×40×35 cm)中央，實驗在強光、白噪聲下進行，觀察5 min。以曠場箱中心點為中心的20 cm×20 cm為中央區，計算小鼠5 min運動總長度、中央區進入次數和中央區停留時間。

1.4.2 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮由開放臂(30 cm×5 cm)、閉合臂(30 cm×5 cm×15 cm)和兩臂匯合的中央區(5 cm×5 cm)組成，距地面50 cm。將小鼠放至兩臂交匯中央，面對閉合臂，實驗在暗光、白噪聲下進行，觀察 5 min，用Ethovision 3.0計算小鼠開放臂進入次數、開放臂停留時間、閉合臂進入次數和閉合臂停留時間。

1.4.3 趨向決擇行為實驗［7］采用自制的T型迷宮，對限食(2 g/d)小鼠進行食物獎賞(米粒大巧克力)訓練共7 d。次日將T型迷宮干支灌入水，箱體門與干支鋪板的距離為7 cm，小鼠必須費力跨過水面才能到達干支，計算小鼠反復試探并跨過水面障礙至吃掉巧克力所需的時間，如5 min結束時仍未吃掉巧克力，則計為300 s。

1.4.4 回避決擇行為實驗［7］將小鼠置于帶電擊實驗裝置T型迷宮(干支末端可電擊)中并給予聲音刺激(5 kHz 75 dB)30 s，接著0.1 mA足部電擊10 s，休息120 s，每天訓練10次，連續訓練7 d。第8天電流升至0.5mA強化訓練3次，次日進行回避決擇行為檢測，同趨向決擇實驗的方法，使干支末端箱體門與鋪板的距離為7 cm。檢測時給予聲音刺激(5 kHz 75 dB)180 s而不給予電擊，小鼠反復試探并跨過水面障礙所需的時間(Latency of Crossing Obstacle)，如180 s結束時仍未逃離箱體，則計為180 s。

1.5 血清皮質酮(CORT)檢測

1.5.1 應激后CORT 將各組小鼠裝入已打孔的50 ml離心管中，使小鼠處于應激狀態，30 min后放出，在動物房用100 mg/kg戊巴比妥鈉快速麻醉，斷頭取血，4℃下放置2 h，待血清明顯析出后，離心(4℃，4000 g)30 min吸取上清，貯存于－20℃備測。

1.5.2 Dex/CRH實驗 實驗結束第2天，在各組小鼠腹腔注射地塞米松(4 μg/100 g)，6 h后再腹腔注射促腎上腺釋放激素(CRH，5 μg/100 g)，30 min后快速麻醉斷頭取血，處理方法同上。血清CORT用放射免疫法檢測，按試劑盒說明操作。

1.6 免疫組化染色

給藥4周后，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射將小鼠快速麻醉(100 mg/kg)，4%多聚甲醛溶液灌注后取腦，后固定12 h，30%蔗糖溶液脫水，恒冷低溫切片30 μm;切片放入盛有0.01 M PBS(pH7.4)的24孔板中平衡30 min。以漂浮法進行免疫組織化學染色，將含有0.5%TritonX-100和2%正常血清的PBS稀釋一抗(GR 稀釋度為 1∶750，11β-HSD2為 1∶4000)，4℃孵育36 h;生物素化的二抗(1∶300)室溫孵育4h，Elite ABC(1∶100，PBS稀釋)室溫孵育 90 min，DAB顯色;以上步驟間用PBS充分漂洗，切片裱于明膠包被的載玻片上并脫水、透明、封片。選擇冠狀面相似的切片用Nikon E200型顯微鏡拍攝圖像，用Imagepro Plus 5.0進行圖像分析，每組選取10張切片，除杏仁體中央核(CeA)選取100 μm×100 μm 區域，余均選取 200 μm ×200 μm 進行圖像分析，記錄觀察區域的陽性細胞數。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 行為學

表1顯示，在曠場實驗中，對照組和模型組比較，氟西汀組小鼠的運動總長度顯著增加(P＜0.01)，溫陽解郁組、氟西汀組中央區進入次數及停留時間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

在高架十字迷宮實驗中，模型組進入開放臂次數明顯降低，溫陽解郁組進入開放臂的次數和停留時間均有所提高，但差異無統計學意義(P＞0.05)，氟西汀組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表1 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠曠場、高架十字迷宮行為的影響(±s)

表1 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠曠場、高架十字迷宮行為的影響(±s)

注:與對照組比較:＊＊P＜0.01;與模型組比較:##P＜0.01

組 別 例數高架十字迷宮實驗5 min運動總長度(cm)中央區進入次數 中央區停留時間(s)開放臂進入次數 開放臂停留時間(s)曠場試驗對 照 組 12 1068.8±291.8 8.7±3.1 16.5±8.3 6.3±3.7 16.10.9±8.0 14.5±6.7 3.0±2.6 16.0±20.2 8±11.9模 型 組 12 1148.0±221.0 9.0±3.1 15.8±8.4 4.0±2.3 16.1±16.9溫陽解郁組 12 1099.5±198.7 6.7±3.2 10.4±6.5 6.0±3.8 26.2±18.5氟 西 汀 組 12 1870.0 ±685.4＊＊##

表2顯示，在趨向與回避決擇反應中，模型組趨向決擇時間和回避決擇時間較對照組明顯延長，但差異無統計學意義(P＞0.05)，溫陽解郁組、氟西汀組趨向決擇時間顯著少于模型組(P＜0.05，P＜0.01);溫陽解郁組回避決擇時間較對照組明顯延長(P＜0.05)，氟西汀組主動回避決擇時間較模型組顯著降低(P＜0.01)。

表2 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠決擇行為的影響(±s)

表2 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠決擇行為的影響(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.01，##P＜0.01

組別 例數 趨向決擇時間(s)回避決擇時間(s)36.8±31.1 10 75.9±20.2 27.6±26.9模 型 組 10 103.8±54.7 62.3±54.7溫陽解郁組 11 61.7±22.1# 91.3±65.1*氟 西 汀 組 10 45.3±12.1＊＊##對照組

2.2 血清CORT

表3顯示，應激后各組血清CORT水平差異無統計學意義(P＞0.05);Dex/CRH實驗后模型組血清CORT水平較對照組顯著升高(P＜0.01)，溫陽解郁組、氟西汀組均較模型組明顯下降(P＜0.05)。

2.3 中樞GR的表達

表4顯示，在海馬CA3區各組陽性細胞均較對照組有所減少，但差異無統計學意義(P＞0.05);在齒狀回(DG)，模型組GR陽性細胞數顯著上升(P＜0.05)，溫陽解郁組較模型組顯著下降(P＜0.05)，氟西汀組較之顯著抬升(P＜0.05)。在杏仁核基底外側核(basolateral amygdale，BLA)，模型組較對照組有所下降，溫陽解郁組、氟西汀組較模型組升高，其中氟西汀組比較差異有統計學意義(P＜0.01);在前額皮質(prefrontal cortex，PFC)，模型組較對照組有所升高，溫陽解郁組、氟西汀組較模型組有所下降，其中氟西汀組差異有統計學意義(P＜0.01);在伏核(nucleus accumbens，NAc)，模型組表達較對照組顯著減少(P＜0.05)，溫陽解郁組與模型組比較差異無統計學意義，氟西汀組有所提升(P＞0.05);海馬 CA1區與中央核(nucleus centralis amygdalae，CeA)變化不明顯(P ＞0.05)。

表3 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠血清CORT 的影響(ng/ml，－x ± s)

表4 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠相關腦區GR的影響(±s)

表4 溫陽解郁復方對母嬰分離小鼠相關腦區GR的影響(±s)

注:與對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:#P ＜0.01，##P ＜0.01

CA1 CA3 DG BLA CeA PFC NAc對 照 組 10 24.1±14.1 16.1±17.0 11.7±11.1 31.1±22.1 2組 別 例數79.0±37.8 4.4±10.8 61.3±39.6 107.3±40.6模 型 組 10 26.4±14.4 9.6± 8.9 21.8±12.6* 24.8±24.0 23.5±10.5 80.6±35.3 50.3±39.7＊＊溫陽解郁組 10 29.9±10.9 7.3± 8.6 11.1±11.8# 28.6±12.5 20.2±12.5 66.1±34.6 39.2±24.9＊＊氟西汀組 10 30.7±11.8 8.2± 9.3 32.5±15.6＊＊#50.1±22.5*##23.8±11.6 45.3±30.5##

2.4 中樞11 β-HSD2的表達

表5顯示，各腦區模型組的11 β-HSD2表達均明顯降低，在海馬CA1區、CA3區、PFC與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01);溫陽解郁組、氟西汀組與對照組比較，在CA3區和DG顯著回升(P＜0.01)，在 NAc明顯升高，但無統計學意義(P＞0.05);圖1顯示，在海馬CA1區和PFC，2個治療組11 β-HSD2表達較對照組顯著降低(P＜0.01)，而與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，余區各組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

表5 溫陽解郁復方和氟西汀對母嬰分離小鼠11β-HSD2表達的影響(±s)

表5 溫陽解郁復方和氟西汀對母嬰分離小鼠11β-HSD2表達的影響(±s)

注:與對照組比較:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較:#P ＜0.01，##P ＜0.01

組 別 例數CA1 CA3 DG BLA CeA PFC NAc對 照 組 10 32.0±19.4 8.1±4.8 9.6±10.6 26.0±11.3 18.2 62.5±39.2± 6.8 57.7±10.3 69.1±35.3模 型 組 10 9.4±14.5＊＊ 2.0±1.2＊＊ 3.6± 2.7 16.2± 8.8 13.3± 6.4 20.1±13.9＊＊ 44.3±31.0溫陽解郁組 10 11.3± 7.1* 6.2±4.3## 23.0±16.3*## 17.2± 8.3 12.4± 6.4 24.3± 7.2＊＊ 73.6±33.0氟 西 汀 組 10 4.0± 3.2＊＊▲▲ 6.2±5.7## 30.0±18.3＊＊##15.9± 9.9 14.3±11.9 22.9±12.1＊＊

圖1 各組小鼠中樞海馬區11β-HSD2免疫組化染色比較

3 討論

3.1 溫陽解郁法對HPA軸的負反饋調節作用

母嬰分離是早年不良經歷的一種常見形式，在20世紀50～60年代，大量研究發現短期的母嬰分離(15 min)可以降低應激后下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸反應［8］，減少焦慮行為［9］。進入 80 年代，發現長時間重復的母嬰分離恰恰得出相反的結果，出現了類抑郁表現。由于延長母嬰分離可以作為抑郁易感性的動物模型進行研究，這引起了眾多學者的注意。

眾多研究表明，抑郁癥的發病與HPA軸的異常激活有關［10］，Dex/CRH實驗是預測抑郁癥復發的有效方法［11］，而母嬰分離可造成HPA軸活動性增加［12］，是抑郁癥潛在的危險因素。HPA軸的負反饋調節發生在大腦中的高位中樞，海馬、杏仁核、前額皮質(PFC)是 HPA 軸反饋抑制的重要位點［13，14］，主要通過GR和MR 2種受體進行負反饋調節。另外11 β-HSD作為糖皮質激素的代謝酶，催化具有活性的11-氧皮質類固醇，即皮質醇(嚙齒類動物為皮質酮)轉化為無活性的代謝皮質素，也起著調節皮質醇的作用。溫陽解郁復方不但可抑制母嬰分離小鼠Dex/CRH實驗中CORT的高漲，還對母嬰分離小鼠海馬CA1區 GR表達的下降、CA3區和 DG 11 β-HSD2表達的下降均有明顯上調作用。11 β-HSD2作為糖皮質激素的降解酶，其含量升高可緩沖應激引起的糖皮質激素升高對中樞神經系統的損害。GR和11 β-HSD2均可減弱 HPA 軸的激活［15］，提示溫陽解郁法可改善母嬰分離小鼠的HPA軸功能，從調節位點來看對海馬DG區的調節作用較為突出。

3.2 溫陽解郁法對行為模式的調節作用

決擇行為的檢測是利用生物趨利避害的本能，把巧克力作為趨向行為的獎賞，把足部電擊作為回避行為的動機，從正反兩個方面反映小鼠的動機水平和學習能力。在此基礎上，加上需要努力才能克服的障礙(跳過水面)，以檢測處于兩難境地時的決擇行為模式。實驗中溫陽解郁復方對曠場實驗行為無明顯影響，但可明顯改善母嬰分離小鼠高架十字實驗中開放臂進入次數，縮短趨向決擇的時間，延長回避決擇的時間，提示溫陽解郁復方可影響母嬰分離小鼠的行為模式，促使其向趨向反應偏移，有利于動機和興趣的恢復。PFC和NAc是決擇行為相關的主要腦區，PFC與認知功能有關，NAc與動機、獎賞有關，2個腦區的功能平衡可使機體能夠對外界環境做出理智的判斷和選擇，規范個體的行為，因此PFC的GR升高加強其對 HPA軸的抑制［16］，強化PFC對NAc的抑制作用，與焦慮/抑郁行為改善關系密切［17］。溫陽解郁復方對PFC的GR表達升高有下調作用，而對11 β-HSD2在NAc的下調有顯著改善作用。下調GR的表達可削弱PFC對其他相關神經核團的抑制作用，11 β-HSD2在NAc的上升，增強對GC升高的緩沖作用，強化與獎賞有關的趨向動機，縮短趨向反應的時間，提示溫陽解郁復方對PFC和NAc間的平衡均有明顯調整作用，從而調節個體的行為模式。

3.3 溫陽解郁復方作用機理分析

幼兒時期陽氣稚弱，受到刺激則陽氣易于折傷，影響情感系統的發育，從而成為抑郁癥發病的1個潛伏因素。根據以上理論和臨床經驗，課題組確定了溫陽解郁法預防和治療早年不良經歷相關抑郁癥，預防用藥主要組成為逍遙散合二仙湯，治療用藥在此基礎上加上活血化痰類藥物。報道顯示，逍遙散可通過神經可塑性變化而起到抗抑郁和抗應激的治療目的［4］。二仙湯及溫陽法早已應用于更年期抑郁癥［18］的治療，因此認為溫陽解郁法影響母嬰分離導致行為模式及HPA軸的相關變化是溫陽和解郁相互配合的結果。

4 結論

溫陽解郁法可明顯影響母嬰分離小鼠的行為模式，強化趨向反應作用;溫陽解郁復方可能通過海馬DG區GR和11β-HSD2的表達，調節相關腦區的神經活動，起到改善HPA軸功能的作用。

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