“寒熱并見”大鼠模型的建立及評價＊

宋捷民，錢旭武，滕 曄，周 堯

(浙江中醫藥大學，杭州 310053)

臨床上寒熱錯雜證，是病人個體在同一時間既有寒證表現又有熱證表現、寒證與熱證混雜而成的一類證候群。從轉換醫學的角度出發，中醫動物模型必須以臨床應用主，強調從實驗室到病床旁的連接。臨床上“寒熱錯雜［1］”證頗多，中醫治擬“寒熱并用”［2］，如治療上熱下寒證之烏梅丸、治寒熱互結中焦證之半夏瀉心湯、治表寒里熱證之大青龍湯、治少陽經寒熱夾雜證之小柴胡湯等。但在中醫現代實驗動物模型的研究中，“寒熱證并見”動物模型的建立尚未見報道。本課題組初次研究并建立中醫寒熱錯雜證動大鼠模型及評價指標，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠20只，體質量180～200 g，購自浙江省實驗動物中心(許可證號SCXK(浙)2008-0033)。

1.2 試劑與藥品

丙硫氧嘧啶片，上海朝暉藥業有限公司(批號1304E16);知母(批號 130301)、石膏(批號130201)、番瀉葉(批號130305)，浙江中醫藥大學中藥飲片有限公司;安琪高活性干酵母由安琪酵母股份有限公司生產;大鼠甲狀腺素(T4)酶聯免疫檢測試 劑 盒 (貨 號 RGB-20259R，LOT20131030、20259R)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)酶聯免疫檢測試劑盒，北京瑞格博科技發展公司;SOD酶聯免疫檢測試劑盒(LOT 201306)、NO酶聯免疫檢測試劑盒(LOT 201306)、MDA酶聯免疫檢測試劑盒(LOT 201306)，上海信帆生物科技有限公司。

1.3 儀器

HC-3018高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;MK3型酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;ZJ202-OA型恒溫干燥箱(滬食藥監械(準)字2005第2400889號)、肛溫計，浙江省諸暨市實驗儀器廠。

2 方法

2.1 造模及給藥

將大鼠隨機分為正常組和模型組，每組10只，適應性飼養7 d后，均無異常表現即納入實驗，標記、稱重。結合陳小野等［3］和盧德趙等［4］的虛寒證造模方法，每天上午灌胃丙硫氧嘧啶100 mg·kg－1，灌胃30 min后放入4℃冰柜中冷凍6 h。下午灌胃100%知母石膏水煎液(知母石膏比例為3∶4)4 mL，第26天起加番瀉葉，空白組灌胃等量生理鹽水。大鼠灌胃共4周，期間各組正常飲水，第29天皮下注射20%干酵母混懸液［5］，使大鼠發熱，造“寒熱并見”動物模型。于注射干酵母10 h后，收集模型組與正常組每只大鼠的大便少許，稱量。于注射干酵母13 h后眼眶取血1mL，檢測 T3、T4、NO、MDA、SOD。

2.2 記錄及觀察

每天上午灌胃前測量大鼠體溫，并觀察大鼠一般狀態，記錄大鼠形態、毛發、爪甲顏色、生活習性、糞便狀態等，一直觀察到第4周(28 d)。第29天，大鼠皮下注射干酵母混懸液后，每小時測量1次體溫。

2.3 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析及t檢驗進行分析。

3 結果

3.1 一般狀態觀察

第1周2組大鼠一般狀態基本無差別，第2周模型組大鼠比正常組活動減少，開始出現毛發無澤、爪甲顏色變淺、體質量下降、大便較軟現象。第3周模型組大鼠出現大便稀軟、弓背蜷縮、愛扎堆、懶動嗜臥、行動遲緩無力、形體消瘦、尾巴變涼、毛發枯槁無華。第4周模型組大鼠上述狀態較第3周更甚。尤其第26天起加灌番瀉葉后，排不成型含大量水和黏液的稀便。這些均符合中醫虛寒證動物模型表現。

3.2 各組體質量比較

表1顯示，正常組大鼠體質量持續上升，模型組大鼠體質量前3周上升，后1周相繼下降，且造模1周即與正常組間比較差異無統計學意義。

3.3 給藥后28 d大鼠肛溫變化

表2顯示，模型組大鼠肛溫從第1周開始出現下降，至第2周后與正常組比較差異有統計學意義，且平均體溫一直比正常組低1℃以上，基礎體溫低下是寒證模型的主要指標變化。

表1 大鼠體質量比較(±s，g)

表1 大鼠體質量比較(±s，g)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組 10 204.7±5.33 256.8± 9.22 284.4± 9.97 315.4±12.38 336.5±15.33模型組 10 205.2±4.08 241.1±11.12* 251.7±13.72＊＊ 256.7±12.14＊＊ 239.9± 8.37＊＊

表2 28 d 大鼠肛溫變化表(±s，℃)

表2 28 d 大鼠肛溫變化表(±s，℃)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.01

組 別 例數0 d 7 d 14 d 21 d 28 d正常組 10 38.00±0.16 38.05±0.17 37.79±0.20 37.47±0.24 37.68±0.22模型組 10 37.94±0.21 37.48±0.19＊＊ 37.25±0.13＊＊ 36.88±0.14＊＊ 36.52±0.16＊＊

3.4 注射干酵母混懸液后，造“寒熱并見”大鼠模型期間96 h肛溫變化

表3顯示，寒熱并見組造模開始時平均基礎體溫低下，比正常組低1.5℃左右，在37℃上下，發熱造模后第8小時寒熱并見組體溫升至39℃，上升2℃，以后40個 h之內一直發熱，體溫在37.8℃至39℃內波動。第48小時后寒熱并見組體溫逐漸下降，第96小時體溫36.7℃，比正常組低1.1℃左右。

表3 模型組大鼠注射干酵母后2組大鼠肛溫比較

3.5 大便含水量變化

表4顯示，大鼠發熱后，收集模型組與正常組每只大鼠大便少許，稱量。再將每只大鼠的大便置于烘箱內干燥至恒重，稱量、記錄、計算含水量。模型組排不成型含大量水和黏液的稀便，與正常組間比較差異有統計學意義。大便含水量=(濕大便重量－干燥后重量)/濕大便重量。

表4 大便含水量比較(±s)

表4 大便含水量比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.05

組 別 例數 含水量正常組10 0.85±0.04模型組 10 0.60±0.050＊＊

3.6 發熱后大鼠血清T3、T4含量的變化

表5顯示，注射干酵母13 h后，模型組與正常組眼眶取血1 ml檢測T3、T4。實驗表明，大鼠發熱后，寒熱并見組大鼠T3、T4含量下降，與正常組比較差異有統計學意義。

表5 血清T3、T4含量比較(±s)

表5 血清T3、T4含量比較(±s)

注:與正常組比較:＊＊P＜0.05

組 別 例數 T3/(nmol·L－1)T4/(nmol·L－1)10 1697.73±113.54 30.39±2.21模型組 10 1156.28± 5.97＊＊ 22.15±0.77正常組＊＊

3.7 發熱后大鼠血清NO、MDA、SOD含量的變化

表6顯示，注射干酵母13 h后，模型組與正常組眼眶取血1 mL檢測NO、MDA、SOD。實驗表明，大鼠發熱后，模型組大鼠NO、MDA、SOD含量下降，與正常組比較差異有統計學意義。

4 討論

表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)

表6 血清NO、MDA、SOD含量(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01，＊＊P＜0.05

組 別 例數 NO(μmo l·L －1)MDA(nmo l·L－1)SOD(U·m L－1)10 30.00±5.00 12.04±0.98 74.68±16.34模型組 10 22.00±5.17* 10.68±1.78＊＊ 57.09± 9.53正常組*

臨床上寒熱錯雜證，是病人個體在同一時間既有寒證又有熱證表現、寒證與熱證混雜而成的一類證候群。但在同一動物體上同時建立既有寒證又有熱證的中醫病證模型是很困難的。前期實驗我們嘗試建立心陽虛寒+胃熱、腎陽虛寒+胃熱、肝火+胃寒等多種寒熱復合模型，最后結果或是單一寒證模型或是單一熱證模型，或是寒象熱象都不明顯，或是死亡率極高。總結經驗后我們認為，“寒熱錯雜”動物模型的建立，最大的阻礙是寒熱致病因素的對立性。在動物模型的建立過程中，寒熱因素可產生相互抵消、相互中和、相互損傷的作用，而如何減少寒熱因素相互抵消是建立寒熱錯雜證的關鍵。

若秋等［6］分析寒熱錯雜證所現癥狀、體征共117個，主要是胃腸癥狀群與外部外征。認為寒熱錯雜證的出現可能是以機體功能狀態低下為前體，虛損癥是寒熱錯雜證的重要表現之一。我們以臨床常見的脾胃虛寒又感風熱，形成表熱里寒證之發熱、頭痛、咽喉腫痛、大便溏泄、四肢不溫為模板，采用丙硫氧嘧啶和寒涼中藥石膏、知母、番瀉葉長時間灌胃的方法，加上冰柜中冷凍等多因素復合造模法制作虛寒證模型。在此基礎上，皮下注射干酵母混懸液致大鼠發熱，造成約40 h左右的“寒熱證并見”動物模型。此動物模型以虛寒為本、表熱為標，表熱難以影響虛寒之本，寒熱因素相互抵消較少，較成功地研究復制出中醫寒熱錯雜證大鼠模型。“寒熱并見”動物模型造模后，寒熱癥狀診斷標準的建立與評價是很重要的。

4.1 體溫

體溫的高低是首要評價標準，本實驗模型組大鼠肛溫下降，7 d后與正常組比較差異有統計學意義。直至第28天，平均體溫一直比正常組低1℃以上，證明虛寒證模型已建立。注射干酵母混懸液后8 h模型組體溫升至39℃，以后40 h之內體溫在37.8℃至39℃內波動，這表明模型組在虛寒證基礎上發熱并出現熱證。第48小時后出現寒熱并見模型組的體溫逐漸下降，第96小時體溫36.7℃，比正常組低1.1℃左右。這一點說明40 h寒熱錯雜模型結束后，模型組體溫又回歸原本虛寒證的狀態。

4.2 大便

同一動物不可能同時有高低2個體溫，寒熱錯雜模型組出現發熱和寒證指標只能從體溫以外指標中尋求。本實驗根據虛寒證多便溏的臨床特點，在大鼠發熱后收集每只大鼠的大便計算含水量。結果模型組排不成型含大量水和黏液的稀便，與正常組比較含水量差異有統計學意義。實驗證明，大鼠發熱同時呈現出虛寒證便溏的疾病癥狀，并可以量化檢測。

4.3 實驗室指標

因為大鼠不可能與人直接交流，人與大鼠很多癥狀表現存在差異，單純從癥狀診斷評價動物模型存在局限性。因此，實驗室指標的建立是評價“寒熱錯雜”動物模型的重點。李敏等［7］研究發現，虛寒狀態下大鼠甲狀腺激素T3、T4水平降低。薛春苗等［8］將甲狀腺軸(T3和/或T4)作為虛寒模型Ⅰ級指標，Ⅰ級指標在虛寒模型中最重要，肯定會有變化，其中甲狀腺軸T3或T4或二者均顯著降低。黃仕文［9］等通過對寒凝胸痹大鼠研究發現，其模型組(未給藥)NO、SOD水平均明顯低于空白對照組。蘇健［10］等對月經病寒凝血瘀證患者研究發現，患者組血漿NO有降低趨勢。實驗結果表明，大鼠發熱后寒熱錯雜組的大鼠T3、T4、NO、SOD含量下降，與正常組比較差異有統計學意義。表明機體在發熱時可同時表現出虛寒狀態，而MDA含量降低，可能是因為動物機體在寒熱因素的共同刺激下，生物機能低下、代謝紊亂的結果，具體原因尚待研究。

總之，應用多因素復合造模法制作虛寒證模型，在此基礎上皮下注射干酵母致大鼠發熱，造成約40 h左右的“寒熱并見”動物模型是可行的。該造模方法簡單易行、成功率高、數據量化，能模擬寒熱錯雜證臨床表現及病理生理過程，為進一步科學闡釋“寒熱并用”的配伍機制、探索寒熱藥性、研究“寒熱并用”方劑和治法提供了新的技術平臺。

［1］栗德林，樸勝華.寒熱錯雜證探微［J］.中醫藥學報，2003，31(6):15-17.

［2］周永學.論方劑配伍中的寒熱并用［J］.現代中醫藥，2002(5):3-4.

［3］陳小野，周永生，樊雅莉，等.大鼠虛寒證模型的研制［J］.中國動物實驗學報，2001，9(3):155-159.

［4］盧德趙，沃興德，李毅，等.溫補腎陽藥對丙基硫氧嘧啶引起腎陽虛大鼠肝線粒體蛋白質組的影響［J］.中華中醫藥雜志，2007，22.

［5］盧芳，董培良，陳平平，等.3種熱病證候模型最佳造模方法的探索與評價［J］.山東中醫雜志，2009，28(2):114-116.

［6］若秋，劉渡舟.寒熱錯雜證之研究［J］.陜西中醫，1991，12(1)22-24.

［7］李敏，張冰，劉小青，等.虛寒狀態大鼠cAMP變化機制的實驗研究［J］.中國中醫藥信息雜志，2010，17(2):33-344.

［8］薛春苗，張冰，金銳，等.虛寒狀態動物模型的評價研究［J］.中華中醫藥雜志，2012，27(8)2037-2041.

［9］黃仕文，戴啟剛.烏頭赤石脂丸對寒凝胸痹大鼠血液黏度、TXB2、6-keto-PGF1α、ET、NO、SOD 及 MDA 的影響［J］.山西中醫學院學報，2012，13(3):56-58.

［10］蘇健，杜慧蘭.月經病寒凝血瘀證與ET、NO的關系及加減溫經湯對其影響［J］.中成藥，2007，29(11):1571-1574.