c-Myb截短突變體的構建及其對c-Myc蛋白表達的調節

秦璽 ，程龍，饒春明，高凱，楊琦，史新昌，徐小潔，葉棋濃，王軍志

1.中國食品藥品檢定研究院 生物制品檢定所，北京1 000502；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850

轉錄因子c-Myb 由原癌基因c-Myb編碼，分別由DNA結合區（DNA binding domain，DBD）、轉錄激活區（central transactivation domain，TAD）、負調節區（negative regulatory domain，NRD）和亮氨酸拉鏈構成，是一個進化上高度保守的蛋白[1]，與白血病、結直腸癌、乳腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的發生發展相關[2-4]。c-Myb 促進細胞的增殖，主要通過調控其靶基因的轉錄來實現自身功能。c-Myc是c-Myb 的靶基因，c-Myb 能夠結合到c-Myc基因啟動子的2個區域，調節c-Myc基因的轉錄和表達[5-8]。c-Myc 在20%的腫瘤患者中處于活化狀態，c-Myc 表達的增強，會促進細胞惡變，最后導致腫瘤的發生[9-10]。臨床標本中c-Myb 的表達與c-Myc 的表達呈正相關性，但c-Myb 各結構域對c-Myc 的調節及作用機制還不清楚。為了進一步明確c-Myb 各結構域對c-Myc 的調節，我們構建了c-Myb 不同結構域的截短突變體，分別命名為c-Myb-1、c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-4、c-Myb-5和c-Myb-6，并在乳腺癌細胞中檢測了這些突變體對c-Myc 表達水平的調節，為進一步研究c-Myb各結構域的功能及其在腫瘤中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T、乳腺癌細胞MCF-7、真核表達載體pcDNA3.0-FLAG、c-Myb野生型質粒pcDNA3.0-FLAG-Myb、c-Myc由本室保存；大腸桿菌感受態細胞DH5α、細胞裂解液購自天根生化科技有限公司；DMEM 培養基和胎牛血清購自GIBCO公司；限制性內切酶KpnⅠ、XhoⅠ，DNA 連接酶，高保真Taq酶試劑盒購自NEB 公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR 回收試劑盒購自Promega 公司；c-Myc 抗 體、HRP-FLAG 抗體和GAPDH 抗體購自Sigma 公 司；SDS-PAGE 膠 和PVDF 轉膜系統購自Invitrogen 公司；PCR 引物（表1）合成和DNA 測序由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 c-Myb截短突變體的構建

以野生型c-Myb為模板，分別進行重組PCR 擴增，膠回收PCR 產物；用KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切PCR 產物和空載體pcDNA3.0-FLAG，膠回收酶切產物，16℃連接4 h，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，涂布含氨芐西林的LB 平板，37℃過夜生長；挑取平板上的克隆做菌落PCR鑒定，陽性克隆提質粒后用KpnⅠ和XhoⅠ酶切鑒定。

1.3 Western印跡

轉染48 h 后收集細胞，加入細胞裂解液及SDS-PAGE 加樣緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，上清液進行SDS-PAGE，電泳后將蛋白轉至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用一抗孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，二抗孵育1 h，TBST洗膜3 次，每次7 min，將含辣根過氧化物酶的ECL底物滴于膜上反應5 min，吸干后用X線膠片顯影。

表1 PCR引物及序列

2 結果

2.1 c-Myb 截短突變體表達載體的構建及酶切鑒定

野生型c-Myb結構域如圖1所示[14]。其中，DBD分為R1、R2和R3 區，均起到與DNA 結合的作用。用引物Y1和Y2 擴增c-Myb 的DBD和TAD 區基因，即為c-Myb-1基因序列，長度為978 bp；用引物Y1和Y3擴增c-Myb 的DBD 區基因，用引物Y4和Y5擴增c-Myb 的NRD 區前段基因，用引物Y1和Y5 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 前段基因擴增到一起，即為c-Myb-2基因序列，長度為833 bp；用引物Y1和Y3擴增c-Myb 的DBD 區基因，用引物Y6和Y7擴增c-Myb 的NRD 區后段基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 區后段基因擴增到一起，即為c-Myb-3基因序列，長度為1160 bp；用引物Y1和Y5 擴增c-Myb 的DBD、TAD和NRD 區的前段基因，即為c-Myb-4基因序列，長度為1230 bp；用引物Y1和Y2 擴增c-Myb 的DBD和TAD 區基因，用引物Y6和Y7 擴增c-Myb 的NRD 區后段基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將這2 段基因擴增到一起，即為c-Myb-5基因序列，長度為1556 bp；用引物Y1和Y3 擴增c-Myb 的DBD 區基因，用引物Y4和Y7 擴增c-Myb 的NRD 區基因，用引物Y1和Y7 重組PCR 將c-Myb 的DBD和NRD 區基因擴增到一起，即為c-Myb-6基因序列，長度為1526 bp。將上述6 段PCR擴增片段與pcDNA3.0-FLAG 分別酶切、回收、連接、轉化后，挑取單克隆PCR鑒定，陽性克隆提取質粒后進行雙酶切鑒定，結果c-Myb-1～c-Myb-6酶切條帶均在預期大小位置出現（圖2）。將酶切鑒定為陽性的克隆測序，測序結果與預期序列一致，說明c-Myb各突變體構建成功。

圖1 c-Myb野生型和截短突變體結構圖

2.2 c-Myb突變體的表達鑒定

將c-Myb的各截短突變體陽性克隆提取質粒后轉染293T 細胞，陰性對照轉染pcDNA3.0-FLAG 空載體，陽性對照轉染pcDNA3.0-FLAG-Myb，48 h 后收集細胞，裂解后用HRP-FLAG 抗體進行Western印跡檢測，用GAPDH 抗體檢測內參。結果顯示，野生型c-Myb和各截短突變體在膜上相應位置均檢測到明顯條帶，表明各c-Myb突變體均可表達（圖3）。

2.3 c-Myb 各突變體對c-Myb 下游靶基因c-Myc 表達的影響

用野生型c-Myb和c-Myb 各突變體分別轉染乳腺癌細胞株MCF-7，6 h后換液，在37℃培養48 h后收集細胞，裂解后做Western 印跡，結果見圖4。相比于野生型c-Myb，含有TAD 區的突變體c-Myb-1、c-Myb-4、c-Myb-5 都能夠促進c-Myc 的表達，而不含TAD 區的突變體c-Myb-2、c-Myb-3、c-Myb-6 則對c-Myc 沒有促進作用。說明c-Myb 對c-Myc 的調控發生在c-Myb 的轉錄調控區，而DNA 結合區和負調節區則沒有對c-Myc的調控作用。

圖2 c-Myb各突變體重組質粒的KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測c-Myb及各突變體在293T細胞內的表達

圖4 Western印跡檢測MCF-7細胞中c-Myb及c-Myb各突變體對內源c-Myc表達的影響

3 討論

c-Myb 包含DBD、TAD、NRD 等3 個結構域和1個亮氨酸拉鏈，在本研究中，我們構建了不同結構域的截短突變體，突變體均以DBD 為基礎，加上TAD或NRD，并在乳腺癌細胞中檢測了上述突變體對c-Myb 下游基因c-Myc表達水平的調節，發現含有轉錄激活區的突變體均能上調c-Myc 的表達，說明c-Myb 對c-Myc 表達的促進作用依靠c-Myb 的TAD 區來執行。c-Myb 對其他下游靶基因的調節是否也依賴于TAD結構域，還須實驗來證明。

c-Myb 在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用，在所有雌激素受體（ER）陽性的乳腺癌細胞中，c-Myb 均高表達[15-16]，c-Myb 是雌激素受體陽性乳腺癌細胞增殖所必需的，在對化學誘導的乳腺癌細胞分化中，c-Myb 的表達被下調，顯示了c-Myb 下調增強了乳腺癌細胞的分化和凋亡[17]。ERα和c-Myb 在乳腺癌細胞中的異常表達和相互作用，提示c-Myb 參與了雌激素誘導的乳腺癌發生、發展、演變等諸多過程[18]。本研究以乳腺癌細胞為模型，證明c-Myb 的TAD 結構域能夠升高乳腺癌細胞中c-Myc 的表達，由于ERα也能夠促進c-Myc 的表達，因此，c-Myb 對c-Myc 的調控是否需要ERα的參與，以及c-Myb 直接調控還是通過ERα間接調控c-Myc，還須進一步的實驗證實。

構建c-Myb 不同結構域的突變體，深入探討c-Myb 不同結構域的功能，有利于研究c-Myb 在惡性腫瘤中發揮功能的分子機制，能夠更明確c-Myb 作為成藥靶點的區域和調節作用，對于研發特異性高，毒性低的抗腫瘤靶向新藥具有重要意義。

[1]Kobe B,Deisenhofer J.Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor,a protein with leucine-rich repeats[J].Nature,1993,366(6457):751-756.

[2]Weinstein Y,Ihle J N,Lavu S,et al.Truncation of the cmyb gene by a retroviral integration in an interleukin 3-dependent myeloid leukemia cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,1986,83(14):5010-5014.

[3]Thompson M A,Ramsay R G.Myb:an old oncoprotein with new roles[J].Bioessays,1995,17(4):341-350.

[4]Schomburg C,Schuehly W,Da Costa F B,et al.Natural sesquiterpene lactones as inhibitors of Myb-dependent gene expression:structure-activity relationships[J].Eur J Med Chem,2013,63:313-320.

[5]Bechard M,Dalton S.Subcellular localization of glycogen synthase kinase 3 beta controls embryonic stem cell self-renewal[J].Mol Cell Biol,2009,29(8):2092-2104.

[6]Minghetti P P,Norman A W.1,25(OH)2-vitamin D3 receptors:gene regulation and genetic circuitry[J].FASEB J,1988,2(15):3043-3053.

[7]陳蕊,張瑩,趙麗.c-Myc 與c-myb 基因在白血病中的研究進展[J].腫瘤防治研究,2011,38(10):1207-1210.

[8]Wang M,Wei X,Shi L,et al.Integrative genomic analyses of the histamine H1 receptor and its role in cancer prediction[J].Int J Mol Med.2014,33(4):1019-1026.

[9]Nesbit C E,Tersak J M,Prochownik E V.MYC oncogenes and human neoplastic disease[J].Oncogene,1999,18(19):3004-3016.

[10]Li Z,Van Calcar S,Qu C,et al.A global transcriptional regulatory role for c-Myc in Burkitt's lymphoma cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):8164-8169.

[11]Wilson A,Murphy M J,Oskarsson T,et al.c-Myc controls the balance between hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation[J].Genes Dev,2004,18(22):2747-2763.

[12]Hock H,Hamblen M J,Rooke H M,et al.Gfi-1 restricts proliferation and preserves functional integrity of haematopoiet-ic stem cells[J].Nature,2004,431(7011):1002-1007.

[13]Guo Y,Niu C,Breslin P,et al.c-Myc-mediated control of cell fate in megakaryocyte-erythrocyte progenitors[J].Blood,2009,114(10):2097-2106.

[14]Greig K T,Carotta S,Nutt S L.Critical roles for c-Myb in hematopoietic progenitor cells[J].Semin Immunol,2008,20(4):247-256.

[15]Cesi V,Casciati A,Sesti F,et al.TGFβ-induced c-Myb affects the expression of EMT-associated genes and promotes invasion of ER+breast cancer cells[J].Cell Cycle,2011,10(23):4149-4161.

[16]Mitra P,Pereira L A,Drabsch Y,et al.Estrogen receptor-α recruits P-TEFb to overcome transcriptional pausing in intron 1 of the MYB gene[J].Nucleic Acids Res,2012,40(13):5988-6000.

[17]Drabsch Y,Robert R G,Gonda T J.MYB suppresses differentiation and apoptosis of human breast cancer cells[J].Breast Cancer Res,2010,12(4):R55.

[18]Edavana V K,Penney R B,Yao-Borengasser A,et al.Fulvestrant up regulates UGT1A4 and MRPs through ERα and c-Myb pathways:a possible primary drug disposition mechanism[J].Springerplus,2013,2:620.