改良抗體結合實驗檢測滅活狂犬病疫苗效價

陳繼軍，馬超，秦海燕，馬瑞，毛曉燕

蘭州生物制品研究所有限公司，甘肅 蘭州 730046

小鼠中和試驗法（NIH 法）是測定狂犬病疫苗效價的標準方法，但該方法耗時長（28 d），結果易受動物質量、操作人員技術等多種因素的影響，重復性較差；需要使用大量動物，成本高，也不符合動物人道主義和3R原則[1]，因此WHO建議積極尋找適宜的替代方法進行狂犬病疫苗的效價檢測。快速免疫熒光灶抑制試驗（rapid fluoresce focus inhibition test，RFFIT）能夠特異、快速、靈敏地測定狂犬病毒中和性抗體[2]，是WHO 推薦的抗狂犬病病毒免疫球蛋白測定方法，也是《中華人民共和國藥典》2010 年版收錄的測定方法。我們結合抗體結合試驗和免疫熒光灶抑制試驗，初步建立了改良抗體結合試驗（modified antibody binding test，M-ABT）檢測狂犬病疫苗效價的方法。該方法通過將待檢測疫苗連續稀釋，與已定量的人抗狂犬病免疫球蛋白標準品于37℃中和1 h，加入80%感染劑量的狂犬病毒CVS-11，于37℃中和1 h 后接種BSR 細胞，培養24 h，經丙酮固定后，使用熒光標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體檢測細胞感染情況；同時將疫苗標準品按同樣方法處理并觀察感染情況，通過公式計算待檢測疫苗中的抗原含量。該方法快速、靈敏、重復性好，無需試驗動物，在48 h 內即可獲得結果，在狂犬病疫苗的生產過程中具有較好的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

12～14 g 雌性昆明系小鼠來自蘭州生物制品研究所實驗動物室；M-ABT 用狂犬病毒CVS-11毒株、BSR 細胞來自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所；狂犬病疫苗參比品、待檢測樣品（純化滅活的aG 株疫苗）、動物實驗用CVS 來自蘭州生物制品研究所疫苗二室；人抗狂犬病免疫球蛋白標準品來自中國藥品生物制品檢定所；FITC 標記的抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體購自北京康思爾泰醫學科技發展中心；新生胎牛血清（FBS）購自Sigma 公司；DMEM 及胰蛋白酶購自Gibco 公司；IX-71 倒置熒光顯微鏡為奧林巴斯公司產品。

1.2 80%細胞感染量CVS-11株測定

取一塊96 孔板，加入100μL 含10% FBS 的DMEM 培養液；取100μL CVS-11 病毒液加入第一孔，混勻；吸出100μL 加入下一孔，混勻；重復上述步驟，連續12 孔；每孔取出50μL 稀釋好的病毒，加入另一96 孔板中，再加入50μL 1.0×106/mL BSR細胞，37℃、5% CO2培養24 h；棄去培養板中的液體，每孔加入200μL PBS 洗1 次，甩干后加入200μL 80%冷丙酮，-20℃固定15 min，棄丙酮，室溫干燥15 min；用PBS 將FITC 標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體1∶200稀釋，按1∶1000加入1%伊文思藍，混勻，每孔加入50μL 稀釋好的抗體，37℃孵育1 h；棄去液體后每孔加入200μL PBS，洗3 次；加入25μL 50%甘油，在倒置熒光顯微鏡下觀察，80%細胞被感染孔對應的CVS-11濃度即為80%病毒感染劑量。

1.3 改良抗體結合實驗（M-ABT）

1.3.1 抗原中和 取一塊96 孔板，加入100μL 含10% FBS 的DMEM 培養液；取100μL 待檢樣品加入第一孔，混勻；吸出100μL 加入下一孔，混勻；重復上述步驟，連續稀釋8 孔，最后一孔吸出100μL棄去；狂犬病疫苗參比品做同樣處理；每孔加入100μL 0.1 U/mL 的人抗狂犬病毒免疫球蛋白國家標準品；取100μL DMEM 加入100μL FBS作為抗體陰性對照；37℃中和1 h。

1.3.2 病毒感染 每孔取100μL混合液，加入另一塊96 孔板中，加入80%細胞感染量的CVS-11 病毒株50μL；另取含10% FBS 的DMEM 培養液100μL，加入80%感染CVS-11 毒株50μL，作為病毒對照；37℃孵育1 h，加入1.0×106/mL 的BSR 細胞50μL，37℃、5% CO2培養24 h。

1.3.3 熒光灶檢測及疫苗效價計算 棄去培養板中的液體，每孔加入200μL PBS 洗1 次，甩干后加入200μL 80%冷丙酮于-20℃固定，15 min 后棄丙酮，室溫干燥15 min；用PBS 將FITC 標記的抗狂犬病毒核蛋白抗體按1∶200稀釋，按1∶1000加入1%伊文思藍，混勻，每孔加入50μL 稀釋好的抗體，37℃孵育1 h；棄去液體后每孔加入200μL PBS，洗3次；加入25μL 50%甘油，在倒置熒光顯微鏡下觀察。抗體陰性對照及病毒對照應一致，并感染約80%細胞。記錄各樣品50%感染分界點前后孔內細胞感染比例，50%細胞孔中出現熒光灶的最高稀釋度為待測疫苗和疫苗參比品的50%陽性終點。依據Reed&Muench 法，疫苗效價（U/mL）=（待測疫苗50%陽性終點對應稀釋度/疫苗參品50%陽性終點對應稀釋度）×（待測疫苗劑量/疫苗參比品劑量）。

1.4 小鼠中和試驗（NIH法）

待檢測樣品及參比品按1∶25、1∶125及1∶625稀釋，腹腔注射昆明鼠，每稀釋度6 只，1 周后再次免疫，14 d 后用約20LD50的CVS 進行腦內攻擊，每只0.03 mL，攻擊后每日觀察，統計第5～14 d 死亡的小鼠，根據參比品計算待測樣品效價。

1.5 統計方法

應用Spss18.0 統計學軟件，采用線性相關分析及配對t檢驗方法。

2 結果

對8 批疫苗生產中連續生產的中間品進行MABT 及NIH 測定效價，結果見表1；2 種方法測定結果呈正相關（R2=0.8749），見圖1；配對t檢驗表明二者無顯著統計學差異（P=0.997）。

3 討論

疫苗效價反映了注射疫苗后產生的抗體水平，是狂犬病疫苗生產中一項關鍵技術指標。NIH 法是狂犬病疫苗效價檢測的標準方法，但該方法周期長，結果受多種因素影響，重復性較差。通過將抗體結合試驗與RFFIT 結合，我們建立了一種檢測aG 株狂犬病疫苗的方法。試驗結果表明，M-ABT 與NIH 法效價檢測結果呈正相關，二者沒有顯著統計學差異，這與其他文獻報道結果一致[3-5]。M-ABT 是一種體外測定狂犬病疫苗效價的試驗方法，與NIH 法相比，具有如下優點：①耗時短，2 d 內即可得到結果，而NIH 法需要28 d；②無需實驗動物，成本低，也符合WHO 提倡的動物試驗3R 原則；③重復性好，結果在不同實驗室之間具有一致性[6]；④操作簡單，通量高，可以大大減少工作量。

表1 M-ABT法和NIH法測定狂犬病毒疫苗效價

圖1 NIH效價與改良抗體結合試驗效價相關關系

除抗體結合試驗外，試驗室替代NIH 法測定狂犬疫苗效價的方法還有競爭ELISA 法[7-8]、火箭電泳法[9]、單向輻射免疫擴散試驗、抗體結合試驗等，但目前NIH 法仍是檢測狂犬病疫苗效價的金標準。在疫苗生產過程中應用M-ABT 有利于加強狂犬病疫苗質量控制，縮短生產周期，節約成本，提高生產效率。

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