Sysmex XN-3000 全自動血細胞分析儀血小板計數性能評價分析

張琴，廖揚，石玉玲

廣州軍區廣州總醫院a.醫學實驗科；b.檢驗科；廣東 廣州 510010

血細胞分析儀現已是各實驗室較為普遍的儀器,血小板（platelet，PLT）計數檢測是臨床血細胞計數檢驗中一項重要的分析指標。然而，血小板由于體積小，尤其是極易發生黏附、聚集和變性破壞反應，給計數帶來了麻煩。我們采用Sysmex XN-3000血細胞分析儀計數血小板的電阻抗法（PLT-I）、光學法（PLT-O）和熒光色素染色法（PLT-F）進行血小板計數，以流式細胞儀為參考標準，從多個方面評價3種方法計數血小板的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集本院2013年6～10月住院、門診患者清晨空腹的血常規標本，用EDTA-K2抗凝。其中血小板＜50×109/L 為低值組，（50×109～125×109）/L 為低中值組，（126×109～350××109）/L為中值組，＞350××109/L為高值組。

1.2 儀器與試劑

Sysmex XN-3000 全自動血細胞分析儀及配套試劑；BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀及配套試劑；藻紅蛋白標記的抗CD61單克隆抗體（CD61-PE）。

1.3 重復性實驗

取低值、低中值、中值和高值4 個水平組各1 份標本，進行10 次連續檢測，計算PLT-I、PLT-O和PLT-F的變異系數（CV）。

1.4 線性實驗

取高值標本（PLT＞600×109/L）1份，分別以原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 稀釋度，用PLT-I、PLT-O和PLT-F方法各做4次測試，取均值與稀釋度理論值做直線回歸分析，以稀釋度理論值為x值，測試值為y值。

1.5 攜帶污染實驗

取1 份高值標本（PLT＞600×109/L）連續3 次計數（記為H1、H2、H3），隨機取1 份低值標本（PLT＜20×109/L）連續3 次計數（記為L1、L2、L3），以（L1-L3）/（H3-L1）×100%分別計算PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法的攜帶污染率（n=7）。

1.6 紅細胞碎片干擾實驗

取1 份血小板計數正常的標本分裝4 管，每管400μL，將第1管3600 r/min離心5 min后取壓積紅細胞層100μL，加入蒸餾水振蕩搖勻后3600 r/min離心5 min，留取紅細胞碎片層用稀釋液反復洗3次后稀釋至100μL，取40μL加入第2管中，作為高碎片濃度干擾組，再將剩下的紅細胞碎片懸液60μL加稀釋液至1 mL，取40μL 加入第3 管中，作為低碎片濃度干擾組。第4 管加40μL 稀釋液作為陰性對照。用PLT-I、PLT-O和PLT-F 方法對上述第2、3、4 管進行檢測，以第2、3 管PLT 測定值與第4 管測定值進行配對t檢驗（n=10）。

1.7 方法對比試驗

取標本在BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀上進行PLT計數，并與Sysmex XN-3000的PLT-I、PLT-O和PLT-F方法計數結果進行比較（n=28）。以流式細胞儀得到的PLT＜50×109/L 的標本為對象，與上述3種方法進行比較（n=13）。

1.8 統計學方法

測定數據用SPSS 13.0軟件和Excel軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 重復性試驗

PLT-I、PLT-O、PLT-F 方法的CV 分別為1.1%～24.3%、2.1%～11.0%和0.0～3.5%。XN-3000 對PLT精密度設置要求為CV≤4.0%。見表1。

2.2 線性實驗

PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的線性理論值與實測值具有良好的相關性，見圖1。

2.3 攜帶污染實驗

PLT-I、PLT-O和PLT-F 等3 種方法的平均攜帶污染率分別為0.25%、0.26%、0.09%，均符合XN-3000攜帶污染率PLT設置要求（≤1.0%）。見表2。

2.4 紅細胞碎片干擾實驗

以PLT-I、PLT-O和PLT-I 檢測的高濃度組、低濃度組分別與自身對照組做配對t檢驗。結果表明，在高濃度紅細胞碎片干擾的情況下，PLT-I、PLT-O測定值與對照組之間的差異有統計學意義（P＜0.05）；在低濃度紅細胞碎片干擾的情況下，PLT-I測定值與對照組之間的差異有統計學意義（P＜0.05），而PLT-O 測定值與對照組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）；無論是在高濃度還是低濃度紅細胞碎片干擾下，PLT-F 法測定值與對照組之間的差異均無統計學意義（均為P＞0.05）。見表3。

表1 3種PLT檢測方法的重復性

表2 3種PLT檢測方法的攜帶污染率（%）

圖1 3種血小板計數方法的線性理論值與實測值的相關性

2.5 方法對比試驗

PLT-I、PLT-O、PLT-F 檢測方法與流式細胞儀檢測的相關系數r分別為0.995、0.997和0.997（圖2），其中PLT＜50×109/L 的低值標本的相關系數r依次為0.917、0.920和0.929（圖3）。

3 討論

血小板由骨髓中成熟的巨核細胞分化產生，具有黏附、聚集、分泌三大功能，在生理性止血及纖溶系統中起重要的作用，因而血小板計數對出血性疾病、放療、化療患者的療效監測具有重要意義，也是血液系統疾病診斷的一個重要指標。但因其體積小、無色、易黏附，及易受小紅細胞、紅細胞碎片、血小板聚集和免疫復合物等干擾，計數往往不能精確反映實際數量。因此，外周血中血小板的準確計數一直是臨床上的難題之一。

表3 紅細胞碎片對3種PLT檢測方法的干擾效果

世界衛生組織（WHO）推薦的血小板計數方法，是以10 g/L 的草酸銨溶液作為溶血稀釋液，在相差顯微鏡下用血細胞計數板肉眼計數[1-2]。該方法容易受到充池、血小板在計數板上的分布、技師的主觀判斷等誤差因素影響，重復性較差且費時，已不適用于臨床工作的需求[3]。血小板計數的參考方法是國際血液學標準委員會（ICSH）推薦的使用抗CD61 抗體和抗CD41抗體的流式細胞術[4-5]。該法簡便迅速，敏感性和特異性高，尤其適用于低值血小板標本的測定，但須使用專用抗體，成本較高，不適合臨床常規標本測定。

現今的全自動化血液分析儀一般PLT-I和PLT-O 法計數血小板。PLT-I 是根據血細胞相對非導電的性質，懸浮在電解質溶液中的血細胞顆粒在通過計數小孔時引起電阻的變化，以此為基礎對血細胞進行計數。PLT-O采用半導體流式細胞檢測原理，對每個血小板從高低角度進行二維激光掃描，即用前向散射光檢測血小板體積，由熒光強度提供核酸信息進行內部結構的確認和計數。Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀使用的PLT-F 是利用能給血小板染色的熒光色素給血小板染色，采用流式細胞術檢測前向散射光和側向散射光，根據檢測數據繪制出二維散點圖進行計數。

圖2 3種血小板計數方法與流式細胞儀方法的相關性（n=28）

圖3 低值標本血小板計數與流式細胞儀方法的相關性（n=13）

我們參照ICSH、美國臨床和實驗室標準協會和中國實驗室國家認可委員會制定的評價標準[6-8]，對Sysmex XN-3000 全自動血液分析儀的PLT-I、PLTO和PLT-F 等3 種測試方法進行了性能評價。重復性實驗中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 在中值組和高值組的CV 均低于4.0%；而PLT-I和PLT-O 在低值組和低中值組的CV＞4.0%，PLT-F 的CV＜2.0%；并且PLT-F 在各組血小板濃度計數的CV 均比其他2 種方法低。可見，PLT-F 的精確度較高，PLT-I和PLTO 的精確度較差，尤其在低血小板計數時。線性實驗中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關系數分別為0.999、1.000、0.999，3 種方法線性理論值與實測值具有良好的相關性。攜帶污染實驗中，PLT-F 的平均攜帶污染率最小，PLT-O 的最大，PLT-I 介于兩者之間，但均≤1%，符合PLT攜帶污染率設置要求。紅細胞碎片干擾實驗中，PLT-I 的抗干擾能力一般，輕度溶血時即可影響其血小板的測定；PLT-O 檢測血小板的能力優于PLT-I，輕度溶血時不影響，但重度溶血時其檢測血小板的結果不可信[9-10]；PLT-F 具有較強的抗干擾能力，不易受標本溶血的影響。另外，與使用抗CD61 抗體的流式細胞術比較，PLT-I、PLTO、PLT-F 方法均具有良好的相關性；在低值血小板中，PLT-I、PLT-O和PLT-F 的相關 系數分別為0.917、0.920和0.929，PLT-F 與流式細胞術的相關性良好，準確性較高。所以，對于PLT 減少的患者，如再生障礙性貧血、急性白血病、原發性血小板減少性紫癜、彌散性血管內溶血等情況下，用PLT-F法進行檢測可得到更可靠的結果。

綜上所述，臨床工作中，常規標本可以使用Sysmex XN-3000全自動血液分析儀的PLT-I和PLT-O法，當血小板計數、形態異常或溶血時，建議使用PLT-F 通道復查，必要時用鏡檢法或流式細胞術復查和確認，這樣在節約試劑成本的同時保證血小板計數結果的可靠性，更有利于指導臨床，為臨床提供更可靠的信息。

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