大腸桿菌菌蛻裝載質粒DNA實驗方法的優化

胡岸 ，吳婷，陳翀，檀英霞，張士坤，冷泠，李素波，高紅偉，季守平

1.中南大學 生物科學與技術學院，湖南 長沙 410012；2.軍事醫學科學院 野戰輸血研究所，北京 100850

核酸疫苗是一種新型疫苗，與傳統疫苗相比，其具有成本低廉、易于構建和改造、導入抗原提呈細胞后可持續表達產生很強的免疫應答等顯著優勢，自1990 年被偶然發現以來發展迅速，成為當前分子生物學和免疫學中新的研究熱點[1]。但核酸疫苗的免疫原性低下、誘發的免疫效果不佳，一直制約著其臨床應用[2]。因此，核酸疫苗研究領域的一個關鍵問題是如何提高核酸疫苗的免疫原性及其誘發的免疫反應效果。研究者們使用各種方式以提高核酸疫苗對疾病的免疫保護能力，比如改變接種部位，使用脂多糖、分支桿菌等佐劑，結合電傳轉染技術等[3]，但增效作用都有限。鑒于抗原提呈細胞在核酸疫苗免疫應答過程中發揮至關重要的作用，因而提高核酸疫苗活性的根本途徑在于高效、特異地將核酸疫苗導入抗原提呈細胞，并使它得到高效表達[4]。這個過程中運載核酸的載體非常關鍵，制備合適的DNA 導入載體成了研究者試圖提高核酸疫苗活性的重要策略。

近年來，菌蛻（bacterial ghosts，BG）被認為是極具潛力的核酸疫苗載體[4]。菌蛻是將細菌細胞壁裂解、去除細胞質內容物之后形成的細菌空殼。菌蛻保留了較為完整的細胞壁結構和免疫原性，因而其表面結構可以有效地與抗原提呈細胞相互作用，誘發強烈的免疫反應。同時，菌蛻可以裝載核酸疫苗，將其導入抗原提呈細胞中。當裝載核酸疫苗的菌蛻進入體內時，宿主的抗原提呈細胞就會主動識別菌蛻，從而提高菌蛻裝載的核酸疫苗在抗原提呈細胞中的表達水平，進而增加抗原提呈及免疫應答水平。菌蛻的發現和運用，為研究核酸疫苗載體提供了一個全新的技術平臺[5]。

在以往的研究中，我們初步建立了菌蛻的制備及裝載核酸疫苗的方法，發現菌蛻確有靶向運載核酸疫苗的作用。但菌蛻裝載DNA 的效率不穩定，且裝載質粒DNA 后的菌蛻轉染抗原提呈細胞的效率也有待提高[6]。在本實驗中，我們以大腸桿菌DH5α制備菌蛻，在文獻報道及前期工作基礎上，優化菌蛻裝載質粒DNA 的條件，以獲得更高且更穩定的裝載效果。鑒于破碎大腸桿菌后的細胞膜（即膜囊）能影響裝載效率，其濃度過高或過低都會導致裝載效率低下，我們摸索并優化了菌蛻、質粒和膜囊三者的最佳濃度比例。檢測裝載效率后，使用裝載質粒DNA的菌蛻轉染抗原提呈細胞RAW264.7（巨噬細胞系）和DC2.4（樹突狀細胞系），優化轉染條件，進一步分析菌蛻作為DNA 疫苗載體裝載質粒DNA 并將其導入抗原提呈細胞的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW264.7 巨噬細胞株和DC2.4 樹突狀細胞為本室保存；大腸桿菌DH5α購于全式金公司；pHH43質粒為德國Rainer Hass 教授惠贈；質粒pDSred-N1購于BD Clontech 公司；pVAXI-mIi-TM 為本室構建；胎牛血清、胰酶、DMEM 培養基和1640 培養基購于Gibco 公司；PI 購于Sigma 公司；HEPES 購于Amresco 公司；Mito Tracker 購于Invitrogen 公司；氯霉素、青霉素、鏈霉素購于華北制藥有限公司；質粒大量抽提試劑盒購于威格拉斯公司；DNA marker DL2000購于TaKaRa公司。

1.2 菌蛻的制備

轉化pHH43 質粒至感受態大腸桿菌DH5α中，在氯霉素抗性LB 固體培養基上于28℃培養過夜，挑出單克隆菌落轉接至LB培養基中，恒溫搖床過夜培養，隨后以1∶100 擴大培養，待D600nm為0.5 時于42℃誘導，當D600nm值降到0.3 以下時離心收集菌體，加入50 mL 無菌水重懸，并加入200 U/μL 青霉素、鏈霉素各100μL，4℃靜置過夜，取上清離心，沉淀懸浮，4℃靜置過夜，小心取出上清，離心，棄除上清，用無菌水重懸沉淀，此時溶液均勻，無絮狀不溶物，再次離心，收集的沉淀即為菌蛻，用無菌PBS重懸，混勻，測定菌蛻濃度。

1.3 膜囊的制備

以1∶1000 將大腸桿菌DH5α轉入LB 培養基中培養，再以1∶100 將大腸桿菌轉入LB 培養基培養過夜，離心收集菌體，棄上清，沉淀稱重，用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0，含20%蔗糖）重懸（每克菌體加入4 mL），每克菌體加入600μg 溶菌酶，依次加入0.1 mol/L EDTA、0.5 mol/L MgCl2，離心收集菌體，沉淀重懸于冰冷的10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中，超聲波破碎，離心收集上清，40 000 r/min 離心1 h，沉淀重懸于2 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）中。

1.4 菌蛻裝載質粒

參照威格拉斯大提質粒試劑盒說明書提取質粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM，測定DNA 濃度。取質粒pDSred-N1和pVAXI-mIi 質粒各1 mg，加入400μL 冰冷的無水乙醇，充分混勻，室溫靜置10 min，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀溶于50μL HBS 中，測定質粒DNA 的濃度；取菌蛻，6000 r/min 離心10 min，棄上清，用冰冷的CaCl2反復洗滌菌蛻（6000 r/min 離心10 min），棄上清，向菌蛻中加入10μL HBS，混勻；按菌蛻140μg/質粒200μg 的比例向菌蛻中加入質粒，加入HBS 定容至20μL，輕輕混勻，28℃水浴1 h；取出膜囊，按200μg 質粒/80μg 膜囊的比例加入，加入13μL 0.1 mol/L CaCl2，輕輕混勻后于37℃過夜。

取出-20℃凍存的Mito Tracker染料，融后混勻，取0.5μL 稀釋至500μL PBS 中，混勻，取出37℃孵育的裝載混合液，每管加入35μL 染料，37℃靜置15 min，2000 r/min 離心10 min，加入PBS 定容至500μL，加入細胞核熒光染色劑PI 2μg/mL，混勻，用流式細胞術測定裝載效率。

取制備的菌蛻和裝載質粒pDSred-N1 的菌蛻，分別用掃描電鏡（HITACHI S-4500）和透射電鏡（Philps-EM 400T）觀察菌蛻的外膜結構，以及菌蛻裝載質粒前后的結構變化。

1.5 抗原提呈細胞吞噬菌蛻

37℃、5% CO2條件下培養巨噬細胞RAW264.7和樹突狀細胞DC2.4；取菌蛻裝載的質粒pDSred-N1 1 mg（菌蛻用Mito Tracker 染色），與2 mL 無血清的Opti-MEM 培養基混勻，分別與RAW264.7細胞和DC2.4 細胞孵育過夜，用PBS 洗滌1 次，激光掃描共聚焦顯微鏡（Bio-Rad Radiance2100）觀察抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效果。按上述方法取1×106細胞，用流式細胞術測定抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效率。

2 結果

2.1 菌蛻的制備

質粒pHH43 為溫控型表達載體，可在42℃誘導表達φX174 噬菌體的裂解蛋白（E 蛋白），裂解革蘭陰性菌。結果表明，在誘導過程中D600nm值明顯下降并維持在0.3 以下，提示大腸桿菌得到了有效裂解。將裂解細菌洗滌、離心，獲得菌蛻。將大腸桿菌在堿裂解液中超聲波破碎，獲得裂解的大腸桿菌。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，與大腸桿菌及其裂解液相比，菌蛻內DNA已隨著細胞內容物被洗去（圖1）。

2.2 菌蛻裝載質粒的效率

本研究采用的裝載方法是在本研究室前期工作基礎上加以改進。分別用PI 將質粒pDSred-N1和pVAXI-mIi-TM 染色，菌蛻用Mito Tracker 標記；將不同比例的質粒DNA 與菌蛻混合孵育后，用膜囊將菌蛻封閉，以優化裝載條件。流式細胞術檢測結果（圖2）表明，當質粒DNA、菌蛻、膜囊混合的比例為10∶7∶4 時裝載效率達到最高，2 種質粒的裝載效率都達到了98%以上，其中片段較長的質粒pVAXImIi-TM 的裝載效率幾乎為100%。以上結果說明菌蛻可以有效裝載質粒DNA，且裝載效率不會受DNA片段大小的影響。

2.3 掃描電鏡和透射電鏡觀察菌蛻和裝載質粒的菌蛻

為了檢測大腸桿菌是否得到了有效裂解，以及菌蛻是否能夠有效裝載質粒DNA，我們將制備得到的菌蛻和裝載質粒的菌蛻在掃描電鏡和透射電鏡下進行觀察。掃描電鏡結果顯示（圖3A），在菌蛻的兩端出現孔狀結構，提示大腸桿菌被成功地誘導裂解，在菌體兩端形成了非常明顯的裂解通道。透射電鏡的結構顯示，制備的菌蛻內部基本不著色，提示其DNA 等內容物基本洗滌干凈（圖3B）；反之，裝載質粒DNA 的菌蛻內部有有較多的高密度物質（黑色絮狀物）（圖3C），提示菌蛻裝載質粒DNA的效率較高，可以作為很好的質粒DNA載體。

2.4 抗原提呈細胞吞噬菌蛻的效率

為了檢測菌蛻是否能有效導入抗原提呈細胞，增強質粒DNA 的提呈效率，我們用激光共聚焦顯微鏡檢測了裝載質粒DNA 的菌蛻（Mito Tracker 標記）轉染抗原提呈細胞RAW264.7和DC2.4，發現幾乎所有RAW264.3 細胞內都可以觀察到綠色熒光信號，提示Mito Tracker 標記的菌蛻被巨噬細胞吞噬到胞內（圖4）。

圖1 大腸桿菌和菌蛻的DNA電泳圖

圖2 流式細胞術測定菌蛻裝載質粒的效率

圖3 掃描電鏡和透射電鏡觀察裝載質粒DNA前后的菌蛻

進一步用流式細胞術定量分析轉染效果，結果見圖5，RAW264.7和DC2.4 細胞轉染菌蛻后，Mito Tracker 的綠色熒光強度明顯增強，將轉染前后的峰圖擬合，轉染后的峰明顯右移，且峰形較好，說明基本上所有細胞均有吞噬現象，效率幾乎高達100%，從而顯示出標記在菌蛻表面的綠色熒光。部分細胞內的熒光強度較弱，提示其吞噬菌蛻的量較少。流式細胞術結果表明，菌蛻能夠高效導入抗原提呈細胞，這對增加DNA 疫苗在抗原提呈細胞中的表達水平是非常有益的。

3 討論

φX174噬菌體的裂解基因E編碼一個含91個氨基酸殘基的膜蛋白，該蛋白能夠融合革蘭陰性菌的內外膜，并在菌膜上形成一個直徑為40～200 nm 的特異性跨膜孔道。跨膜孔道的形成使得革蘭陰性菌內外滲透壓發生改變，細胞內容物由裂解孔道排出，生成菌蛻。采用這種方法已成功地制備了大腸桿菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌等的細菌菌蛻[7-8]。在菌蛻制備過程中，細菌表面的抗原結構沒有受到任何化學和物理作用的損傷，保留了活菌樣的完好形態結構，如脂多糖、肽聚糖和包膜特異性受體等免疫刺激成分，因而能夠被巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原提呈細胞主動攝取，具有免疫系統靶向性質[9]。故而裝載核酸的菌蛻能夠靶向性地將DNA 導入抗原提呈細胞，是良好的DNA 疫苗遞送載體。菌蛻可經口服、皮下、肌肉注射等途徑使用，可操作性極強[10]。此外，作為細菌空殼，菌蛻沒有感染能力，具有安全性好，易于制備、保存等優點，有望成為安全有效的核酸疫苗遞送載體，被廣泛開發用于各個領域，如腫瘤疫苗的設計和發展、靶標藥物和微酶反應等[11]。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察標記菌蛻被巨噬細胞RAW264.3吞噬

圖5 流式細胞術檢測抗原提呈細胞

高效地將質粒DNA 裝載到菌蛻中，是菌蛻介導的核酸疫苗遞送能否成功的關鍵步驟。Pauker等發現每個菌蛻可以裝載6000 個質粒DNA，容量很大，且裝載質粒的菌蛻能靶向到小鼠巨噬細胞，表達率為60%[12]。但我們參照他們的方法裝載質粒DNA 卻一直沒有成功。究其原因，Pauker 等直接將DNA 與菌蛻混合，以包被質粒，但他們提供的實驗方法中缺少將裝載的DNA 封閉在菌蛻中的關鍵步驟，導致裝載在菌蛻中的DNA 在洗滌過程中丟失。在前期研究中，我們用大腸桿菌菌蛻裝載質粒DNA 之后，用大腸桿菌膜囊封閉菌蛻，成功地將質粒DNA 裝載在菌蛻內[13]，使用裝載質粒DNA 的菌蛻轉染巨噬細胞Raw264.7，報告基因的表達效率可超過50%。但前期研究的裝載效率偏低，且不穩定，原因可能是只對菌蛻和質粒的濃度比例進行了探索，沒有優化膜囊濃度。在本研究中，我們將大腸桿菌DH5α超聲波破碎后，離心收集破碎的細胞膜成分，即膜囊。我們發現膜囊能影響菌蛻裝載效率。膜囊濃度過低，裝載質粒的菌蛻不能完全封閉；膜囊濃度過高，會影響菌蛻裝載質粒效率。我們對菌蛻、質粒和膜囊三者的最佳濃度進行了摸索和優化，彌補了之前研究的空缺。結果表明，質粒、菌蛻、膜囊三者的濃度比為10∶7∶4 時可達到最高裝載效率，效率穩定維持在98%以上，多數情況可高達100%。

為了測定菌蛻裝載質粒DNA 的效率，我們按照之前的方法將DNA 用PI 染色，菌蛻包被質粒，隨后菌蛻用Mito Tracker 標記，用流式細胞術檢測裝載。然而在檢測過程中，我們發現PI 染色效果不好，同樣裝載方法的所獲得產物的檢測值波動較大。這可能是由于用PI 染色后，菌蛻包被過夜處理、Mito Tracker 標記菌蛻等步驟對熒光染料PI 產生了不利影響。于是我們嘗試菌蛻包被質粒后，用Mito Tracker 標記菌蛻，再用PI 將質粒染色，用流式細胞術檢測。這樣改進后，PI 濃度僅為2μg/mL 即可成功染色，而且染色效果比改進前要好。PI 對質粒DNA 的染色效果非常穩定，同種裝載條件所獲得的檢測結果也非常穩定。

最后，我們優化了菌蛻介導的轉染程序，發現裝載DNA 的菌蛻濃度對轉染效率的影響很大。當菌蛻濃度為0.5 mg/mL 時，可獲得良好的轉染效率。激光共聚焦顯微鏡檢測結果顯示，幾乎所有細胞內部均可看見綠色熒光，提示RAW264.7 及DC 等抗原提呈細胞能夠高效吞噬菌蛻。流式細胞術檢測結果顯示2種細胞對菌蛻的吞噬效率均為100%。

綜上所述，我們成功地制備了菌蛻，優化了菌蛻裝載質粒DNA 的條件，建立了穩定的裝載方法及裝載效率的檢測方法，提高了菌蛻裝載DNA 的裝載效率，使菌蛻裝載幾乎達到100%。在轉染實驗中，幾乎在100%的抗原提呈細胞內均可檢測到菌蛻，提示菌蛻確實是一種靶向有潛力的高效遞送載體，能高效進入巨噬細胞并使攜帶的質粒DNA 獲得高水平表達。今后我們將通過動物實驗探討菌蛻提高DNA 疫苗免疫應答水平的可能性。我們相信，隨著對免疫科學進一步的探索，菌蛻高效運載核酸的潛力將進一步被挖掘，成為治療疾病的強有力工具。

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