番茄環斑病毒納米熒光顆粒試紙條的研制

李鑫，劉卉秋，胡強，曹冬梅，曹際娟

遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001

番茄環斑病毒（Tomato ringspot Nepovirus，ToRSV）是線傳病毒組成員，可感染105 屬157 種草本和木本植物，主要感染果樹和漿果作物，屬我國對外的一類檢疫性有害生物。ToRSV 的檢測方法主要有生物學、血清學和電鏡技術，ELISA和PCR 是應用最多的2 種檢測方法。但上述技術普遍存在對人員、環境要求高的問題，難以進行現場快速檢測。

免疫層析技術是上世紀90 年代發展起來的一種基于抗原抗體反應的簡便快速檢測技術，該技術已廣泛應用于臨床、食品安全檢測領域。現有的免疫層析產品所使用的標記物多為膠體金和彩色乳膠顆粒，用這些顆粒制成的免疫層析試紙條可以用肉眼直接判讀結果，使用起來十分方便。但此類試紙條產品的靈敏性普遍較差，還不能滿足快速、高靈敏檢測的需要。稀土熒光納米顆粒含有稀土離子與螯合劑形成的螯合物，該螯合物可在紫外光激發下發射出特征性熒光。我們采用稀土熒光納米顆粒作為標記物研制的熒光納米顆粒試紙條，具有檢測更為快速、準確的特征，可廣泛應用于ToRSV感染組織的現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光納米顆粒及ToRSV多克隆抗體購自深圳易瑞生物技術有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；羊抗鼠IgG 購自中晶生物公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜購自Millipore 公司；所用試劑均為分析純產品；檢測樣品由本中心保藏。

1.2 熒光顆粒單抗偶聯物的制備

取熒光顆粒50μL（10 mg/mL），加入550μL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）、100 mg/mL 的sulfo-NHS和EDC 各200μL，室溫搖動30 min；離心，棄上清；用1 mL 50 mmol/L 的MES（pH6.0）重懸顆粒；加入適量單克隆抗體，室溫振搖1 h；加入等體積的PBSBSA（BSA 含量2%，pH7.4），繼續反應1 h；離心，棄上清；用50 mmol/L 的MES（pH6.0）洗滌顆粒3 次，1 mL/次；用300μL 重懸液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），10%蔗糖］重懸顆粒，4℃保存，備用。

1.3 納米顆粒試紙條的制備

1.3.1 檢測線 以多克隆抗體為硝酸纖維素膜上的檢測線包被抗原。將稀釋好的包被抗原用點膜儀以1μL/cm 的量噴于粘在PVC 底板上的硝酸纖維素膜上，置干燥密閉的37℃真空烘箱內烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.2 質控線 以羊抗鼠IgG 包被硝酸纖維素膜，作為質控線。將稀釋好的羊抗鼠IgG 用點膜儀以1μL/cm 的量噴于粘在PVC 底板上的硝酸纖維素膜上，置干燥密閉的37℃真空烘箱內烘烤60 min，取出后放在干燥皿中待用。

1.3.3 試紙條裝配 在硝酸纖維素膜的兩端分別粘貼吸水墊和樣品墊，吸水墊和樣品墊均與NC膜重疊3 mm。裁成5 mm寬的條狀，4℃干燥保存。

1.4 試紙條特異性的檢測

1.4.1 樣品提取 取1 g 待檢物葉片于潔凈塑料袋中，加 入3 mL PBST（1×PBS，0.5% Tween-20，pH7.4），揉搓塑料袋中的葉片，所得汁液即為待測樣本。采用小西葫蘆花葉病毒（ZYMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、煙草花葉病毒（TMV）、番木瓜環斑病毒（PRSV）、南瓜花葉病毒（SqMV）、煙草環斑病毒（TRSV）、甜瓜壞死斑點病毒（MNSV）和黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）作為特異性檢測的參照，取樣方法同上。

1.4.2 檢測 在反應杯中加入4μL熒光顆粒-單抗偶聯物、200μL提取物（汁液），吹打混勻10次，40℃孵育3 min，插入試紙條繼續反應5 min，紫外光下肉眼觀察結果。

1.5 試紙條穩定性的檢測

將試紙條和熒光顆粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，每天檢測陽性樣品，觀察其穩定性。

1.6 熒光試紙條與膠體金試紙條靈敏性比較

1.6.1 膠體金試紙條的制備 膠體金試紙條的制備參照Frens的方法[1]。檢測時在反應杯中加入適量膠體金-單抗偶聯物、200μL提取物（汁液），吹打混勻10 次，40℃孵育3 min，插入試紙條繼續反應5 min，肉眼判讀結果。

1.6.2 靈敏性比對試驗 用PBST 將同一份陽性樣本分別稀釋至1/8、1/16、1/32、1/64、1/128，分別用膠體金和免疫層析方法進行檢測。

2 結果

2.1 熒光納米顆粒試紙條的制備

試紙條裝配結構如圖1。在底板上依次緊密搭接的樣品墊7、層析膜8和吸水墊9；層析膜8 上設有檢測區81和質控區82，檢測區81 固定有與ToRSV發生特異性反應的多克隆抗體，質控區82 固定有羊抗鼠IgG。

2.2 特異性檢測結果

用制備的熒光納米顆粒試紙條檢測ToRSV及其他8 種參照病毒的陽性樣本，除ToRSV 外，其余均無交叉反應。典型實驗結果如圖2所示。

2.3 穩定性檢測結果

將試紙條和熒光顆粒及提取液（1×PBST）于37℃放置7 d，進行連續檢測試驗，結果表明試紙條和熒光顆粒及反應液的靈敏性沒有明顯降低，表明該試紙條的穩定性較好。

2.4 熒光試紙條與膠體金試紙條靈敏性比對

靈敏度對比試驗結果（表1）顯示，當陽性樣本稀釋至1/32時，膠體金試紙條不能觀測到顯色反應，而熒光試紙條仍可檢出；當稀釋到1/64時，熒光試紙條無任何反應。由此可以看出，熒光納米顆粒試紙條對樣品的濃度要求要低于普通膠體金試紙條，其有較高的靈敏性。

圖1 試紙條裝配結構圖

圖2 典型實驗結果（紫外光下）

表1 不同方法的靈敏性比對

3 討論

目前，雖然已經有一些用免疫層析試紙條檢測微生物的報道[2-3]，但靈敏性都不夠理想，標記物的信號強度弱是一個很重要的原因。熒光納米顆粒中含有多個熒光顆粒，具有良好的發光性能，熒光信號也遠遠強于傳統的標記物質。本研究將免疫層析技術和熒光納米顆粒標記技術相結合，建立了番茄環斑病毒的免疫層析檢測法。該方法的原理、操作過程和結果判讀與膠體金免疫層析試紙條相似，但熒光納米顆粒試紙條在傳統膠體金結構上進行了改進，將原來的可結合膠體金顆粒的結合墊取消，改為將熒光顆粒與待測樣品相混合的方式，使其充分反應，完全擯棄了膠體金依靠被動物理吸附的標記方式，從而提高了檢測效率及熒光信號的強度。目前該試紙條已獲國家實用新型專利（ZL201320706434.4）。

免疫學檢測技術在植物病毒檢測中具有靈敏、特異、簡便、高通量等優勢，因此得以廣泛應用[4]。近20 年來，不斷有一些新的免疫學檢測技術被應用于微生物的檢測中，如時間分辨熒光技術（TRFIA）[5]、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）[6-7]、膠體金免疫層析技術（GCIA）[8]等。高強度的熒光信號保證了檢測方法具有良好的靈敏性，且穩定性試驗結果說明本研究所建立的免疫層析檢測系統亦具有良好的穩定性。

番茄環斑病毒熒光納米顆粒檢測試紙條的研制成功，為該病毒的快速檢測提供了一個極好的檢測方法，便于現場或田間檢測的開展，為生物安全工作提供了便利，也有助于其他植物病毒或微生物的快速檢測方法研究。

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