一個水稻β-肌動蛋白基因的克隆及其亞細胞定位

李培培 ，謝禮，薛進，3，羊健，李靜，嚴成其，張恒木，陳劍平

1.浙江師范大學 生化學院，浙江 金華 321000；2.浙江省農業科學院 省部共建國家重點實驗室培育基地，農業部植物保護與生物技術重點實驗室，浙江省植物病毒重點實驗室，浙江 杭州 310021；3.植物疾病控制與利用湖南省高校重點實驗室，植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南農業大學，湖南 長沙 410128

肌動蛋白是真核生物中普遍存在的一種結構蛋白，具有高度的保守性[1]。植物肌動蛋白是一種單一的多肽鏈球狀蛋白，由375～377 個氨基酸殘基組成，其相對分子質量約為42×103[2]。根據肌動蛋白等電點的不同，可將其分為3類：α-肌動蛋白主要分布于各種肌肉細胞中，β-肌動蛋白與γ-肌動蛋白主要分布于肌細胞和非肌細胞中。β-肌動蛋白與γ-肌動蛋白是不同類型的細胞中最為豐富的蛋白質，一方面在維持和調節細胞基質的結構中起關鍵作用；另一方面，它們還是非肌肉細胞化學信號傳導系統的重要組成部分，并與肌動蛋白結合蛋白共同參與細胞的各種生理活動，如易位及細胞形態的改變[3]。

β-肌動蛋白是主要的細胞骨架蛋白，在真核細胞中有至關重要的作用[4]。該蛋白高度保守，并常被用作“內參基因”[5]。β-肌動蛋白以螺旋的方式聚合成肌動蛋白絲（或微絲），構成真核細胞三維網絡結構骨架，為細胞提供機械支持并決定細胞的形態。此外，β-肌動蛋白還參與許多細胞生理過程，包括細胞黏附、細胞遷移或移動、細胞分裂、胞質分裂、胞吞/胞吐作用、信號轉導、mRNA 定位和轉錄等[6]。近期的研究表明，β-肌動蛋白可以通過與熱激蛋白90相互作用來調節血小板一氧化氮合酶3 的活性[7]。有報道β-肌動蛋白與病毒的增殖和裝配有關，當β-肌動蛋白受到細胞松弛素D（一種肌動蛋白聚合抑制劑）的干擾時，傳染性支氣管炎病毒粒子的裝配和出芽會被阻斷[8]。用肌動蛋白抑制劑處理細胞時，可以在滲透部位看到細胞的防御反應，如細胞質聚集、核運動、形成乳突及過敏性細胞死亡[9-12]。Song 等[13]的研究表明，肌動蛋白細胞骨架結構及肌動蛋白結合蛋白在由小麥條銹菌引起的小麥條銹病的防御反應中有重要作用。

以植物肌動蛋白為主形成的動態微絲骨架系統已成為植物細胞生物學研究領域的熱點之一[9]。有關植物肌動蛋白基因家族的研究比較透徹的是擬南芥（Arabidopsis thaliana）。擬南芥的肌動蛋白家族包含10 個肌動蛋白基因（actin genes，ACT），其中8個編碼的功能蛋白ACT1/3/4/11/12 與生殖生長相關，ACT2/7/8 與營養生長相關，另外2 個（ACT5與ACT9）有可能是假基因[14]。在水稻中已克隆出很多肌動蛋白基因，但有關其功能與定位的研究報道還很少。我們克隆了一個水稻β-肌動蛋白基因，并利用膠體金免疫電鏡技術對β-肌動蛋白在水稻細胞內的分布情況進行了詳細觀察和描述，為進一步研究肌動蛋白的功能提供亞細胞定位的依據，同時也為維管束細胞學的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

日本晴水稻（Oryza sativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare）樣品采自浙江省農業科學院試驗大田內；大腸桿菌Trans1-T1 感受態細胞、克隆載體pEASY-T5 Zero Cloning Vector 均購自北京全式金生物技術有限公司（TransGen Biotech）；TRIzol 試劑、SuperScriptⅢReverse Transcriptase 試劑盒均為Invitrogen 公司產品；RNase 抑制劑、dNTP Mix、ExTaqDNA 聚合酶、限制性內切酶等購自TaKaRa 公司；凝膠純化試劑盒、質粒提取試劑盒均為Promega公司產品；肌動蛋白鼠單抗購自Agrisera 公司，該抗體針對擬南芥肌動蛋白制備，經公司驗證其對水稻肌動蛋白呈陽性反應；膠體金二抗（10 nm 羊抗鼠的IgG 抗體）購自Sigma 公司；克隆肌動蛋白特異引物與oligo-dT 通用引物均由上海英駿生物技術有限公司合成；其他生化試劑均為國產分析純以上產品。

1.2 cDNA的獲得

用TRIzol 法提取水稻葉片組織的總RNA[15]。采用Invitrogen 公司的逆轉錄試劑盒合成cDNA。取總RNA 2 μg、oligo-dT 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，用DEPC 水補足13 μL，65℃變性5 min 后，置冰上至少1 min，隨后加入5×第一鏈緩沖液4.0 μL、0.1 mol/L DTT 1 μL、40 U/μL RNA 酶抑制劑1 μL、SuperscriptⅢ逆轉錄酶1 μL，組成20 μL 體系，42℃反應10 min，55℃反應1 h，70℃處理15 min，將制備好的cDNA置于-20℃保存備用。

1.3 基因的擴增與鑒定

取cDNA 2 μL、20 μmol/L 上游引物Actin-F（5'-ATGGCTGATTCTGAGGATATTCA-3'）與下游引物Actin-R（5'-TTAGAAGCATTTTCTATGTACAAT G-3'）各0.6 μL、10×EXTaq緩沖液5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL、5 U/μL ExTaqDNA 聚合酶0.5 μL，加ddH2O 補足50 μL 體系，然后運行以下PCR 程序：94℃5 min，94℃30 s，60℃40 s，72℃90 s，35 個循環，循環結束后繼續反應10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE 電泳緩沖液、180 V 電壓）檢測PCR擴增產物，并對目的基因片段進行切膠回收并純化。將純化的目的基因片段通過T-A克隆的方法連接到pEASY-T5 Zero 克隆載體上，然后轉化大腸桿菌Tran1-T1 感受態細胞，PCR 篩選陽性克隆，提取質粒后進行測序分析。

1.4 樣品固定聚合和切片

取新鮮水稻葉片，避開葉脈將其切成1 mm×3 mm 的小片，用0.1 mol/L 哌 嗪-1，4-二乙磺 酸（PIPES，pH7.0）配制的4%多聚甲醛于4℃抽真空固定2 h，經0.1 mol/L PIPES（pH7.0）緩沖液洗滌3 次后，在4℃條件下依次用30%、50%乙醇脫水，-20℃條件下依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇脫水，-20℃條件下依次用30%、70%的用乙醇配置的K4M 包埋劑各滲透3 h，100%純K4M 包埋劑充分滲透6 h后將樣品浸入K4M 包埋劑，置-20℃冰箱中紫外照射聚合72 h，常溫紫外聚合48 h，得到聚合完畢的包埋塊。將樣品包埋塊在Leica UC6 型切片機上切片，厚度70～90 nm，收集于鎳網上進行免疫膠體金標記。

1.5 免疫膠體金標記

將帶有切片的鎳網用BL 封閉液（PBS 緩沖液配置，含1%的BSA、0.02%的PEG20000）于28℃封閉30 min，去離子水漂洗3 次；一抗孵育采用BL 封閉液1∶50 稀釋的肌動蛋白抗體，28℃孵育3 h；去離子水漂洗3 次；二抗孵育采用BL 封閉液1∶100 稀釋的羊抗鼠膠體金（直徑10 nm），28℃孵育2 h；去離子水洗滌3 次，晾干。采用未免疫的血清作為一抗孵育的陰性對照。帶有樣品切片的鎳網經醋酸雙氧鈾（C4H6O6U·2H2O）和檸檬酸鉛（C6H5O7Pb）染液雙染色各15 min 后，用H7650 型透射電鏡（日立公司）觀察，加速電壓為80 kV，采用Gatan830 型CCD 相機（美國Gatan公司）照相。

2 結果

2.1 OsActin的克隆與鑒定

以cDNA 為模板，用特異引物Actin-F/Actin-R進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段與預期1134 bp 大小一致（圖1）。將所得片段回收純化后，連接至pEASY-T5 Zero 載體，轉化大腸桿菌Trans1-T1，挑取若干單克隆進行PCR 擴增鑒定，電泳檢測發現1～3 號與預期大小一致為陽性克隆（圖2），對陽性克隆提取質粒，測序獲得水稻肌動蛋白基因序列，命名為OsActin。

2.2 OsActin的分子進化分析

為了進一步研究克隆得到的OsActin與水稻、擬南芥肌動蛋白基因家族的進化關系，在GenBank 數據庫中下載了部分擬南芥與水稻肌動蛋白的氨基酸序列，利用BioEdit 與MEGA 軟件對其進行比對分析并構建了系統進化樹（圖3）。氨基酸序列分析發現，OsActin 與OsRAc1（GenBank 登錄號：X15865）、擬南芥ACT11（GenBank 登錄號：U27981）的同源性分別高達98%與97%。從圖3 可以看出，OsActin 和擬南芥與生殖生長相關的肌動蛋白ACT1、ACT3、ACT4、ACT11、ACT12 聚集成簇，推測該基因可能也參與調節水稻的生殖生長。

圖1 OsActin目的基因的PCR擴增

圖2 pEASY-T5 Zero-OsActin克隆的PCR鑒定

2.3 水稻肌動蛋白基因的亞細胞定位分析

由于葉肉細胞等細胞的細胞質較多，也可能會干擾觀察，因此我們選用液泡較多細胞質較少的維管束薄壁細胞作為研究對象。利用膠體金免疫電鏡定位技術對水稻維管束薄壁細胞（parenchyma cells of vascular bundle）中的肌動蛋白進行定位研究，發現在細胞核與細胞質中均有大量特異性膠體金顆粒標記，而在液泡中及細胞壁上都沒有觀測到特異性膠體金顆粒標記（圖4）。

3 討論

高等植物細胞都含有一個復雜的細胞結構骨架，該結構是由具有高度動態性和嚴密調節作用的微絲組成的三維網絡結構。細胞定位及一些生理生化研究表明肌動蛋白是植物細胞骨架的基本組成部分，在植物的生長、發育以及對逆境脅迫的響應中起重要作用[16-18]。例如由肌動蛋白與肌球蛋白相互作用組成的肌動球蛋白系統驅動著細胞質流動，還參與了細胞的有絲分裂、細胞器運動、頂端生長、對重力的感應、細胞形狀的控制及葉綠體的流動等。因此，對于肌動蛋白的研究具有重要意義。

圖3 基于水稻與擬南芥肌動蛋白氨基酸序列構建的系統進化樹

圖4 肌動蛋白在水稻維管束薄壁細胞中的定位

在本研究中，我們克隆得到水稻的一個β-肌動蛋白基因，分子進化分析發現該基因編碼的蛋白與水稻OsRAc1 及擬南芥ACT11 的氨基酸同源性分別為98%和97%。擬南芥ACT11 及與其同源的ACT1、ACT3、ACT4 和ACT12 在花粉中均有表達，因此將它們指定為生殖型肌動蛋白。不同的是，ACT11 在幼小組織、花器官原基、新生花蕾、胚珠及成熟的花粉中優先表達，并且是惟一在胚乳和胚發育過程中顯著表達的肌動蛋白，它在生殖器官中獨特的表達模式表明，ACT11 對于擬南芥的生殖發育是必不可少的[19]。OsActin 與擬南芥的ACT11 高度同源，暗示其對水稻的生殖發育也具有重要的作用。對OsActin的亞細胞定位研究發現，該蛋白在水稻薄壁細胞的細胞核、細胞質中均有分布，為進一步研究該基因在水稻生長發育過程中的作用及其超分子結構提供了依據。

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