甲殼胺對HepG2細胞蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶活性的影響

趙麗艷，趙忠鵬，馬守棟，劉金鳳，李明春

1.解放軍第401醫院，山東 青島 266071；2.解放軍第305醫院，北京 100017

甲殼胺又稱殼聚糖、幾丁聚糖，主要是蝦、蟹等海洋甲殼綱類動物外殼的甲殼質脫乙?；蟮漠a物，它由氨基葡萄糖經β-1，4-糖苷鍵連接而成，是自然界天然多糖中惟一的堿性多糖，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、增強免疫力等多種藥理作用[1-4]。本實驗室的前期研究表明，甲殼胺能夠誘導人肝癌HepG2 細胞的凋亡[5]。為進一步探討其作用機制，我們從蛋白質的磷酸化和去磷酸化調節角度，動態監測與細胞生長密切相關的膜相與胞漿蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性，并檢測相應的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）的活性變化，探討甲殼胺在癌細胞內的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌HepG2 細胞（軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供）；水溶性甲殼胺（純度≥95%，脫乙酰化率≥95%，黏度＜200 mPa/s，濰坊海之源生物制品有限公司），用生理鹽水配制成儲備液，使用時用培養基配成所需濃度；RPMI 1640 培養基（Gibco 公司）；PBS 緩沖溶液（武漢博士德生物工程有限公司）；蛋白酶抑制劑（PMSF、aprotinin、leupeptin，Sigma-Aldrich 公司）；CB（E3）型培養箱（Binder 公司）；TGL16 型低溫高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；Elx-800/808型酶標儀（BIO-TEK 公司）。

1.2 細胞培養與分組

傳代HepG2 細胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液在37℃、5% CO2培養箱內培養。取對數生長期的細胞，調整濃度為1×107/mL，加入甲殼胺儲備液，使終濃度為1.0 mg/mL，繼續于溫箱中培養，分別在不同時間準確收集上述濃度的細胞液1 mL，做時間依賴曲線。對照組細胞在加藥前收集。

1.3 蛋白質提取

細胞經PBS 洗滌后，加入預冷的含蛋白酶抑制劑的裂解液，勻漿后于4℃、1200 r/min 離心10 min，收集上清液為總蛋白質。細胞經PBS 洗滌后，加入預冷的低滲裂解液，離心去沉淀，收集上清液為胞漿蛋白質。收集低滲裂解液裂解細胞后經離心得到的沉淀，再次加入裂解液作用30 min，再次勻漿離心后，收集上清液為膜相蛋白質。

1.4 活性測定

采用生物素標記的ELISA 法。蛋白樣本作用于激酶底物，使其酪氨酸殘基發生磷酸化，借助底物上標記的生物素，與鏈親和素包被的酶標板微孔結合；洗去未結合的底物，加入過氧化物酶標記的特異性抗磷酸化酪氨酸殘基抗體，與磷酸化的酪氨酸殘基結合；再洗去未結合的抗體，加入過氧化物酶的催化底物ABTS 進行比色。測定波長405 nm，參考波長490 nm，通過PTK 活性-吸光度（D405nm-D490nm）的標準曲線進行定量，PTK 活性以酪氨酸磷酸肽的生成量表示。PTP 活性測定與PTK 相似，只是生物素標記的磷酸酶底物中相應的酪氨酸殘基是已磷酸化的，以（D對照-D測定）/D對照×100%來定量PTP的相對活性。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度甲殼胺對總蛋白質PTK活性的影響

如圖1，不同濃度的甲殼胺作用HepG2 細胞10 min 后，總蛋白質的PTK 活性均受到抑制，且抑制效應有一定的濃度依賴性，濃度越高，對總蛋白質PTK的活性影響越大，濃度＞1.0 mg/mL 后，抑制率超過20%。經t檢驗，各組濃度的甲殼胺對HepG2細胞總PTK活性均有不同程度的抑制作用（P＜0.05）。

2.2 甲殼胺作用于HepG2細胞后PTK活性的變化

選用濃度為1.0 mg/mL 的甲殼胺作用于HepG2細胞不同時間后測定PTK 活性，結果見圖2。隨作用時間的不同，不同蛋白質樣品的PTK 活性發生了先降后升的動態變化。

2.3 不同濃度甲殼胺對總蛋白質PTP活性的影響

不同濃度的甲殼胺作用于HepG2 細胞后，總蛋白質的PTP活性測定結果如圖3。分析顯示，不同濃度的甲殼胺對HepG2細胞總蛋白質PTP活性的影響無顯著性差異。

2.4 甲殼胺作用于HepG2 細胞后蛋白質PTP 活性的變化

用1.0 mg/mL 的甲殼胺作用于HepG2 細胞不同時間，PTP活性呈先降后升的趨勢，如圖4，同時伴有PTP 的活性變化，可能反映了胞內蛋白酪氨酸殘基的磷酸化與去磷酸化即時調節。

3 討論

HepG2 細胞的凋亡涉及多個信號轉導途徑[6-8]，為深入研究甲殼胺誘導凋亡的機理，我們在多時間點檢測PTK 的活性，以反映其動態變化；同時檢測PTP 的活性變化，反映其體內的調節。結果顯示，不同濃度的甲殼胺對PTK 的活性均有抑制作用，且呈現一定的濃度依賴性，表明甲殼胺可特異性地抑制PTK的活性。

圖1 不同濃度甲殼胺作用HepG2細胞30 min的磷酸肽-甲殼胺濃度曲線

圖2 1.0 mg/mL甲殼胺作用于HepG2細胞的磷酸肽-時間曲線

圖3 不同濃度甲殼胺作用于HepG2細胞后總蛋白質PTP活性曲線

圖4 甲殼胺作用于HepG2細胞不同時間的PTP活性曲線

蛋白質酪氨酸的可逆磷酸化是真核生物調控各種生理活動的重要機制，受作用相反的2 個酶即PTK（催化酪氨酸磷酸化）和PTP（催化酪氨酸脫磷酸化）的調節[9]。真核生物細胞通過這種可逆的平衡來調節細胞間與細胞內的通信，參與細胞的生長發育、調控基因轉錄與免疫等。實驗發現，HepG2 細胞經一定濃度的甲殼胺處理后，總蛋白質、胞漿蛋白質、膜相蛋白質中的PTK 活性均有短暫下降，隨后恢復正常。從下降的時相看，膜相蛋白質中的PTK 活性變化先于胞漿蛋白質中的PTK 活性變化，提示可能存在一個由外而內的跨膜信號轉導過程。甲殼胺對分布不同的PTK 均有抑制作用，推測與細胞的信號轉導有關，但因為膜蛋白的提取過程變性作用更強，可能導致酶活性的下降。而且，由于PTP類型眾多，其確認的家族成員已超過100 個，究竟具體哪些酶在甲殼胺誘導癌細胞凋亡中發揮作用、是否存在特異性受體型蛋白酶等，還有待深入研究。

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