α-半乳糖苷酶清除豬細胞表面的α-Gal抗原

贠志敏，張雪，李素波，檀英霞，冷泠，季守平，高紅偉，宮鋒

軍事醫學科學院 野戰輸血研究所血液分子生物學研究室，北京 100850

人體移植器官嚴重短缺日益受到關注，而異種移植是解決人體移植器官短缺的有效方法之一，也是現代臨床醫學發展的重要熱點問題。豬的器官在結構、大小和生理功能上與人體相近，并且豬易于繁殖，成熟周期短，一胎多子，所患疾病易于控制，在倫理學方面相對于靈長類動物更易接受，因此豬被認為是異種移植最理想的供體之一。

研究表明，α-Gal 抗原是異種移植的主要異種抗原之一，它表達于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動物體內，只是在種類和個體間表達量上有差異[1]。人體內存在天然的抗α-Gal 抗體，將動物的細胞、組織和器官移植給人體，將出現超急性排斥反應（hyperacute rejection，HAR）。這些天然抗體在數分鐘或數小時之后與移植物抗原結合，導致血管內皮被補體成分溶解/破壞，使血管完整性被破壞，進而導致水腫和出血進入下層組織。此外，凝血通路被激活，導致纖維蛋白單體沉淀，微血栓形成，最終致移植物腫脹、色澤暗紅、流血量少、變軟、無彈性、器官功能衰竭。因此，異種移植首先須清除異種抗原。國外的相關研究表明，使用α-半乳糖苷酶能有效清除異種細胞、組織表面抗原末端的α-Gal 殘基，降低HAR強度，延長移植物的存活時間[2-4]。

本實驗室從原核生物脆弱類桿菌（Bacteroides fragilis）中克隆并表達了一種新型α-半乳糖苷酶[5]，屬CAZy GH110 家族。研究表明，該酶不僅可切除支鏈多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R），也可切除直鏈多糖末端的α-Gal（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R）[5-6]。豬體細胞表面的α-Gal抗原是以α-Gal為末端的直鏈多糖結構[7]。我們檢測率豬體細胞表面的α-Gal 抗原，并進行了新型α-半乳糖苷酶去除α-Gal抗原的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

豬胚腎細胞系PK-15 和豬睪丸細胞系ST（培養條件均為高糖DMEM+5%胎牛血清）由野戰輸血研究所章金剛教授惠贈；豬成纖維細胞系11WP1（培養條件為高糖DMEM+15%胎牛血清）和五指山小型豬紅細胞（pRBC）由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所潘登科教授提供。FITC-IB4 凝集素為Sigma 公司產品；流式細胞儀為Cytomics FC 500 Beckman Coulter。

1.2 豬紅細胞的酶解實驗[6]

采集的五指山小型豬抗凝血于500 r/min 離心5 min，棄上層血漿，用酶解緩沖液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）分別按1∶1、1∶4 洗滌紅細胞2 次；按紅細胞壓積為40%加入不同劑量的重組α-半乳糖苷酶，于26℃酶解反應箱內緩慢振蕩孵育2 h，酶解清除紅細胞α-Gal抗原；用PBS 按1∶4洗滌紅細胞2 次，加入1/2 體積的MAP 液保存紅細胞；取部分酶解前后的紅細胞，分別用4%多聚甲醛固定備用。

1.3 豬體細胞的酶解實驗

將培養的細胞用PBS 洗2 次，胰酶消化5 min，血清終止后500 r/min離心3 min，棄上清，將收集的細胞用酶解緩沖液（250 mmol/L 甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）洗滌2 次，分別加入不同劑量（表1）的重組α-半乳糖苷酶，酶解體系為300 μL，細胞數為1×106，于26℃酶解反應箱內緩慢振蕩孵育2 h 后離心棄上清，用PBS 洗滌細胞2 次，用4%多聚甲醛固定備用。

1.4 FCAS 分析酶處理前后細胞表面α-Gal 抗原的含量

IB4是從植物中提取的一種凝集素，可特異地與以α-Gal 為末端的糖鏈結合，而異種抗原（Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R 和Galα1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc-R）是以α-Gal 為末端的糖鏈結構。用FITC-IB4 凝集素（25 μg/mL）標記固定的細胞，室溫反應3 h，用PBS 洗滌2 次，用流式細胞儀檢測紅細胞的熒光強度，按下式計算α-Gal清除率：

2 結果

流式細胞術檢測結果表明，pRBC、PK-15、ST、11WP1 細胞均表達α-Gal 抗原，但表達量明顯不同，11WP1 的表達量最高，平均熒光強度為598，而pRBC 的最低，平均熒光強度只有33，因此各種細胞所需酶量不同（圖1，表1）。用0.04 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，pRBC 表面的α-Gal 抗原清除率可達99.84%；用0.5 mg/mL 的α-半乳糖苷酶酶解2 h 后，PK-15、ST、11WP1 細胞表面的α-Gal 抗原清除率可達90%以上，但仍沒有被完全清除，可能是因為這幾類細胞表面的α-Gal 抗原表達量較高，需要酶解更長的時間。

表1 α-半乳糖苷酶酶解細胞表面α-Gal抗原所需劑量

3 討論

α-Gal 抗原是異種移植的主要異種抗原之一，表達于除人和舊大陸猴外的所有哺乳動物體內。本研究發現，脆弱桿菌來源的α-半乳糖苷酶酶解清除動物紅細胞表面異種抗原α-Gal 的活性遠高于咖啡豆來源的α-半乳糖苷酶。以酶解豬紅細胞為例，咖啡豆α-半乳糖苷酶的使用劑量為2～3 mg/mL[8]，而脆弱桿菌來源的α-半乳糖苷酶的使用劑量僅為0.002 mg/mL，并且酶解環境也從偏酸性變為中性。因此，該新型α-半乳糖苷酶是在異種移植中清除α-Gal 抗原，降低移植引起的HAR的理想工具酶。

雖然酶解法能夠去除主要異種抗原，但移植后存活的異種組織或異種器官仍能繼續分泌α-Gal 抗原，因此這種方法更適于終末期細胞或代謝率較低的組織或器官，如紅細胞、皮膚、關節、韌帶等，已有這些組織異種移植的相關報道和專利[9-11]。本研究證實，我們獲得的來源于脆弱桿菌的α-半乳糖苷酶可用于清除不同類型豬體細胞表面的α-Gal 抗原，提示該酶可用于克服異種移植的HAR，是研制異種皮膚、關節、韌帶的關鍵物質。

圖1 流式細胞術檢測α-半乳糖苷酶處理前后的細胞

[1]Galili U,Shohet S B,Kobrin E,et al.Man,apes,and old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells[J].J Biol Chem,1988,263(33):17755-17762.

[2]Eckermann J M,Buhler L H,Zhu A,et al.Initial investigation of the potential of modified porcine erythrocytes for transfusion in primates[J].Xenotransplantation,2004,11(1):18-26.

[3]La Vecchio J A,Dunne A D,Edge A S.Enzymatic removal of alphα-galactosyl epitopes from poricine endothelial cells diminishes the cytotoxic effect of natural antibodies[J].Transplantation,1995,60(8):841-847.

[4]Luo Y,Wen J,Luo C,et al.Pig xenogeneic antigen modification with green coffee bean α-galactosidase[J].Xenotransplantation,1999,6(4):238-248.

[5]高紅偉,李素波,鮑國強,等.一種來源于脆弱類桿菌的α-半乳糖苷酶的理化性質及其酶解B 型紅細胞的工藝研究[J].中國科學:生命科學,2011,41(10):1030-1036.

[6]高紅偉,張雪,李素波,等.新型α-半乳糖苷酶清除動物紅細胞表面α-Gal抗原的研究[J].中國實驗血液學雜志,2012,20(5):1231-1234.

[7]Liu Q P,Yuan H,Bennett E P,et al.Identification of a GH110 subfamily of α-1,3-galactosidases--novel enzymes for removal of the α3Gal xenotransplantation antigen[J].J Biol Chem,2008,283(13):8545-8554.

[8]Tan Yingxia,Gong Feng,Li Subo,et al.Brief report:a new profile of terminal N-acetyllactosamines glycans on pig red blood cells and different expression of α-galactose on Sika deer red blood cells and nucleated cells[J].Glycoconjugate J,2010,27(4):427-433.

[9]Doucet J,Gao Z H,McLaren L A,et al.Modification of xenoantigens on porcine erythrocytes for xenotransfusion[J].Surgery,2004,135:178-186.

[10]Stone K R,Valley M.Bone xenografts[P].US 6,972,041 B1.

[11]Liu Q P,Clausen H.Method of preparing non-human tissues for xenotransplantation using α-Galactosidases[P].US 7,951,552 B2.