肺炎支原體黏附蛋白P30的高效表達及初步應用

王成紅 ，于傳亭，張奇舒，李鵬飛，王曉丹，修冰水，張賀秋

1.煙臺市煙臺山醫院 檢驗科，山東 煙臺 264000；2.軍事醫學科學院 基礎醫學研究所，北京 100850

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是兒童和青少年非典型肺炎的首要病原微生物[1]，由其引起的臨床癥狀同其他病原體相似，但臨床用藥并不相同[2]，因此，研制靈敏、特異、便捷的快速早期診斷試劑，對于Mp感染的診斷和治療意義重大[3]。

肺炎支原體M129 株的全基因測序工作于1996年完成。M129 基因組全長816 kb，編碼超過400 個功能蛋白[4]。其中P30 蛋白是錨定于Mp 細胞膜上的重要黏附蛋白，包含275 個氨基酸殘基，相對分子質量約為29.7×103，其基因序列全長825 bp。研究顯示P30 蛋白可以激起宿主的免疫反應[5]，是除了黏附蛋白P1 外的另一個重要的黏附素和免疫原。由于Mp采用的是偏性密碼子，其野生基因不適合在大腸桿菌中進行表達。為此，我們利用生物信息學方法和密碼子優化技術設計并獲得優化的Mp 黏附蛋白P30基因序列，實現了其在大腸桿菌中的高效表達。

1 材料和方法

1.1 材料

Mp 患者血清樣本來自煙臺山醫院小兒科住院病人，正常人血清樣本來自煙臺山醫院體檢中心。

TaqDNA 聚合酶為北京百泰克生物技術有限公司產品；T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產品；DNA限制性內切酶XhoⅠ和XbaⅠ購自Promega 公司；PCR 產物回收試劑盒由北京百泰克生物技術有限公司生產；引物由上海英駿生物技術有限公司合成；DNA序列測定由中美泰和生物技術有限公司完成。

1.2 判定標準

樣品與未致敏粒子（最終稀釋率1∶20）的反應圖像判定為（-），而與致敏粒子（最終稀釋率1∶80）的反應圖像判定為（+），則結果判定為陽性。將顯示反應圖像為（+）時的最終稀釋率作為抗體滴度。

1.3 抗原表位分析

從NCBI 網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下載P30 黏附蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列，采用Biosun 生物軟件比對序列，分析P30 的抗原表位情況，確定克隆表達的優勢抗原表位區間。

1.4 肺炎支原體P30黏附蛋白基因的密碼子優化與基因合成

采用Genscript 軟件在線分析P30 基因的密碼子表達情況；采用自編軟件，根據P30 優勢抗原表位的氨基酸序列，設計并優化由大腸桿菌優勢密碼子組成的P30 基因，分段設計并合成引物，采用退火PCR方法合成各基因片段，利用基因片段末端重復序列將各片段搭橋擴增，最終得到完整的P30優化基因。

1.5 原核表達載體的構建

利用分別含XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點的上游引物P30F-XhoⅠ（GCCTCGAGGCCCTCATTGTTC）、下游引物P30R-XbaⅠ（GCTCTAGATTAACGCTTCGG T）對上述基因進行PCR 擴增，從而在基因片段兩端引入酶切位點，經雙酶切回收后插入同樣經XhoⅠ、XbaⅠ酶切的原核表達載體pBVIL1-His，轉化大腸桿菌HB101，挑選陽性克隆，振蕩培養過夜后42℃誘導表達，SDS-PAGE鑒定，對高表達菌株測序。

1.6 抗原表達與純化

鑒定出的陽性克隆于37℃培養過夜后轉至新鮮的LB 培養基，37℃培養2～3 h，至D600nm值為0.4～0.6，42℃水浴誘導表達5 h，離心收集菌體，用TE 緩沖液沖洗菌體并懸起，超聲波破碎細胞，離心收集上清，用Ni 柱分離純化融合蛋白IL1-P30，收集洗脫峰，SDS-PAGE鑒定各步分離產物。

1.7 間接ELISA法評價IL1-P30融合蛋白的抗原性

以純化的IL1-P30 融合蛋白包被酶聯板，用間接ELISA 法對肺炎患者和正常人血清樣本進行測定，根據D450nm值計算S/c，評價重組抗原的反應活性。

2 結果

2.1 肺炎支原體P30黏附蛋白的表位分析

運用Biosun 生物軟件分析比對肺炎支原體P30黏附蛋白的氨基酸序列（GenBank：M57245.1），結果顯示，除75～95 aa區段抗原性較弱外，整個P30蛋白具有較強的抗原性（圖1）。

2.2 肺炎支原體P30黏附蛋白基因的密碼子優化和獲取

野生型P30 基因全長825 bp，由275 個密碼子編碼相應的氨基酸序列。采用Genscript軟件對野生Mp基因進行密碼子分析顯示，約13%的密碼子表達效率低于30%，屬于稀有密碼子，密碼子適應指數（CAI）為0.59（圖2A），屬于Genscript 軟件中定義的難于表達的基因。采用自編程序對P30 密碼子基因優化后，稀有密碼子比率僅為3%，CAI 提高到0.84，屬于Genscript軟件中定義的易表達基因（圖2B）。

采用重疊延伸PCR 方法分4 段分別擴增基因片段，而后相鄰片段末端搭橋退火延伸，最終獲得全長825 bp 的目的基因，測序結果顯示獲得的基因序列正確。

圖1 肺炎支原體P30黏附蛋白氨基酸序列抗原表位預測

圖2 P30基因密碼子分析

2.3 抗原表達與純化

大量誘導表達測序正確的表達菌株，超聲波破碎后SDS-PAGE鑒定，IL1-P30融合蛋白為包涵體表達，相對分子質量為43.5×103，與預期相符（圖3）。

2.4 間接ELISA法評價IL1-P30融合蛋白的抗原性

用純化的IL1-P30 融合蛋白包被酶聯板，用間接ELISA 法初步檢測了47 例正常人和85 例肺炎支原體患者的血清。結果70 份患者血清檢出陽性，42例正常人血清反應陰性，靈敏度和特異性分別為82.35%和89.36%（圖4A），ROC 分析顯示曲線下面積（AUC）為0.9088（圖4B），證明IL1-P30 融合蛋白有較好的抗原活性和特異性。

3 討論

Mp 的早期診斷對疾病的治療具有重要意義。由于Mp采用偏性密碼子，在大腸桿菌中表達較為困難，因此臨床應用較廣的Mp檢測試劑如日本富士冷凝集法和歐蒙試劑均采用滅活的Mp 全菌體提取的膜抗原，工藝復雜，且由于含有大量非活性成分導致試劑的靈敏度低、特異性差。因此，克隆表達的Mp抗原對肺炎支原體的診斷具有重要意義。

在Mp基因組表達的數百種抗原中，研究較多的是黏附蛋白P1，由于其特殊的定位及在致病中的重要作用而成為研究熱點。我們在研究中發現，P1 蛋白雖具有很好的抗原性，但僅靠P1 進行檢測不能覆蓋所有患者，提示除了P1 抗原外，還存在其他重要的抗原表位[6]。Varshney 等克隆表達了P30 抗原，用ELISA 法檢測融合蛋白與Mp 患者血清的反應，測得其靈敏度和特異性分別為78.57%和89.47%[4]，但由于其采用的基因為野生型基因，表達量較低，限制了在診斷和疫苗研制中的應用。

本研究采用密碼子優化結合退火延伸PCR 技術，獲得了CAI 為0.84 的優化的P30 基因，并實現了P30抗原的高效重組表達，表達后的P30抗原具有很好的靈敏度和特異性。這為P30 抗原在Mp 檢測和疫苗中的應用奠定了基礎。

圖3 優化P30基因的表達

圖4 P30抗原活性的ELISA鑒定（A）及其特異性分析（B）

[1]Montagnani F,De Paolis F,Beghetto E,et al.Use of recombinant chimeric antigens for the serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection[J].Clin Microbiol Infect Dis,2010,29(11):1377-1386.

[2]袁壯.肺炎支原體肺炎的診治[J].中國實用兒科雜志,2008,23(8):561-572.

[3]Drasbek M,Nielsen P K,Persson K,et al.Immune response to Mycoplasma pneumoniae P1 and P116 in patients with atypical pneumonia analyzed by ELISA[J].BMC Microbiol,2004,5:4-7.

[4]Himmelreich R,Hilbert H,Plagens H,et al.Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae[J].Nucleic Acids Res,1996,24(22):4420-4449.

[5]Varshney A K,Chaudhry R,Kabra S K,et al.Cloning,expression,and immunological characterization of the P30 protein of Mycoplasma pneumonia[J].Clin Vaccine Immunol.2008,15(2):215-220.

[6]張奇舒,修冰水,宋曉國,等.密碼子優化的肺炎支原體P1 蛋白在大腸桿菌中的克隆表達[J].生物技術通訊,2012,23(3):380-382.