慢病毒載體介導的層黏連蛋白受體穩定抑制細胞株的建立

武瑞琴，朱旭東，周曉巍，黃培堂

軍事醫學科學院a.生物工程研究所；b.疾病預防控制所；北京 100071

層黏連蛋白受體（laminin receptor，LR）又稱層黏連蛋白結合蛋白（laminin binding protein，LBP），是細胞表面的跨膜糖蛋白，最早由Terranova 等[1]從人類乳腺癌細胞表面分離得到。已發現多種LR，根據其結構可分為整合素家族與非整合素家族兩大類。其中，對非整合素家族中相對分子質量為67×103的LR（67kDa LR）的研究最為深入。67kDa LR通過疏水序列與層黏連蛋白的V 區/β1 鏈YIGSR 序列結合，廣泛分布在上皮細胞、內皮細胞及大部分腫瘤細胞表面。層黏連蛋白、Ⅳ型膠原蛋白等構成的基膜是構成腫瘤細胞轉移的主要屏障，因此LR在腫瘤細胞黏附和遷移過程中發揮至關重要的作用[2]。慢病毒是一種導入外源基因的有效手段，通過介導外源基因整合到宿主染色體上，可實現外源基因在宿主中的穩定持續表達。此外，慢病毒的感染效率高，宿主細胞類型廣泛，且不易誘發宿主免疫反應，安全性好，在基因的功能性研究中具有明顯優勢[3]。本研究的目的，是以慢病毒為載體，構建LR 表達穩定抑制的HeLa 細胞株，為深入探討LR 在腫瘤轉移中的作用機制提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

HeLa 細胞、293FT 細胞、慢病毒載體質粒pLenti6/v5-EGFP、質粒pUC-H1、兔抗LR 多克隆抗體均由本實驗室保存；包裝載體質粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG 購自Invitrogen 公司；引物及小發卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）序列由北京奧科生物技術有限公司合成；Pfu高保真DNA 聚合酶購自上海生物工程有限公司；各種限制性內切酶購自NEB公司；T4DNA連接酶、DNA質粒提取試劑盒、質粒大提試劑盒Maxipreps DNA purification System 購自Promega 公司；膠回收試劑盒購自Qiagen 公司；細胞培養基DMEM 和Opti-MEM 購自Invitrogen 公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；羊抗α-actinin、HRP 標記的兔抗羊IgG 購自Santa Cruz Biotechnology 公司；HRP 標記的抗兔IgG 購自Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 H1啟動子的插入

從pUC-H1 載體中PCR 獲得H1 啟動子，末端加入ClaⅠ位點，同時在H1啟動子下游末端ClaⅠ位點之前引入NheⅠ和PacⅠ限制性內切酶位點。擴增H1 的引物為H1-sense（5'-AATTGGATCGATCCATGGAATTCGAACGCTGACG-3'）和H1-antisense（5'-AATTGGATATTTAATTAAGCTAGCGTGGTCTCAATACAGAACTTA-3'）。PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒對H1 條帶進行回收純化；用ClaⅠ酶切pLenti6/v5-EGFP 載體，經瓊脂糖凝膠電泳分離回收酶切產物；將上述回收產物用T4DNA 連接酶連接得到pLenti6/v5-EGFP-H1，轉化大腸桿菌JM109 感受態細胞，于含氨芐西林的LB 平板上于37℃倒置培養過夜；菌落PCR篩選陽性克隆，將陽性克隆接種于含氨芐西林的LB 培養液中，37℃振蕩培養過夜，送華諾公司測序。

1.3 LR靶向shRNA序列的設計

根據NCBI 中LR 的基因序列和Ambion 公司的pSolencer 說明書設計2條shRNA（表1），由北京奧科生物公司合成。

1.4 LR靶向shRNA序列的插入

將合成的shRNA 序列退火，使其形成雙鏈DNA；分別用PacⅠ和NheⅠ雙酶切shRNA 雙鏈和pLenti6/v5-EGFP-H1載體，1%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產物，經T4DNA 連接酶連接得到pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA；將上述載體轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞，轉化細菌接種到含氨芐西林的LB平板上，于37℃倒置培養過夜；利用H1 上游引物和引物6、7 下游序列（引物6 antisense：5'-TTAATTAATTC CAAAAACCTTCACT-3'；引 物7 antisense：5'-TTA ATTAATTCCAAAAATAACAAGG-3'）進行菌落PCR篩選陽性克隆。

1.5 慢病毒的包裝和感染

將pLenti6/v5-EGFP-H1-LRshRNA 載體質粒和包裝質粒共轉染細胞匯合度達到90%的293FT 細胞，以pLenti6/v5-EGFP-H1 為陽性對照。轉染后4 h 換成新鮮的DMEM 培養基（含10% FBS，1 mmol/L丙酮酸鈉，0.1 mmol/L 非必需氨基酸），轉染后72 h收獲并濃縮病毒，4℃、3000 r/min 離心15 min，取上清，加入終濃度為5×10-4g/L 的聚合賴氨酸（PLL），輕輕混勻，4℃孵育30 min，4℃、10 000 r/min 離心2 h，用DMEM重懸，分裝后于-70℃保存。

HeLa 細胞用DMEM 培養液（含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）于37℃、5% CO2條件下培養，感染前1 d 鋪至24 孔板。分別以含有LR-sh6、LR-sh7 及空白對照的病毒感染細胞，感染后48～72 h可在熒光顯微鏡下觀察細胞內的熒光。

1.6 穩定細胞株的篩選

病毒感染后的HeLa細胞于第4 d加入4 μg/mL的殺稻瘟菌素（blasticidin），每隔3 d換一次抗生素，共篩選12 d。篩選后的細胞經胰酶消化后在顯微鏡下計數，用新鮮培養基稀釋后鋪96 孔板，保證每孔僅含1 個細胞，于37℃、5% CO2條件下培養，待長出細胞克隆后在熒光顯微鏡下觀察，發出綠色熒光的克隆即為陽性細胞克隆。擴大培養后，最終獲得陽性慢病毒感染的HeLa細胞系，即HeLa-LR-sh6和HeLa-LR-sh7。

1.7 real-time PCR 檢 測HeLa 細胞中LR 的mRNA表達水平

將HeLa 細胞和穩定表達shRNA 的HeLa-LR 細胞株鋪至24 孔板，于37℃、5% CO2條件下培養48 h后提取總RNA。取0.5 μg 總RNA 為模板，以Oligo（dT）為引物進行反轉錄獲得cDNA。將cDNA 稀釋后作為模板，加入DNA 緩沖液、上下游引物、dNTP和Taqman 探針，進行real-time PCR，根據所得數據計算LR mRNA的表達水平。

1.8 Western 印跡檢測HeLa 細胞中LR 的蛋白表達水平

用NP-40 細胞裂解液裂解已感染病毒的細胞，4℃、12 000 r/min 離心10 min 收集上清，測定蛋白濃度后取一定量的蛋白樣品進行SDS-PAGE 分離蛋白，轉印至PVDF 膜，用TBST 配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，LR 兔抗和α-actinin 羊抗稀釋后室溫孵育1 h，二抗稀釋后室溫反應1 h，加發光液后顯色，檢測LR蛋白的表達水平。

2 結果

2.1 H1啟動子的擴增和插入

以pUC-H1 質粒為模板擴增H1 啟動子，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示得到260 bp 的片段（圖1）。將擴增片段插入pLenti6/v5-EGFP 載體，對連接轉化的菌落進行PCR 鑒定，得到多個陽性克隆（圖2）。挑選2、6、9、12 這4 個陽性克隆測序，結果表明插入的H1 啟動子序列正確（序列略）。

2.2 pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA的構建

將合成的單鏈shRNA 序列的正反鏈緩慢退火形成雙鏈，與經NheⅠ和PacⅠ雙酶切的pLenti6/v5-EGFP-H1 載體連接，用H1 啟動子上游引物和合成的LR-sh6 和LR-sh7 下游引物對連接轉化的菌落進行PCR 鑒定（圖3），表明shRNA 片段連入pLenti6/v5-EGFP-H1，構建成pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA載體，測序結果表明插入的外源序列正確（序列略）。

2.3 穩定表達LR 靶向shRNA 的HeLa 細胞株的獲得

圖1 H1啟動子PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖2 菌落PCR篩選陽性pLenti6/v5-EGFP-H1重組子

用構建的pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh6 和pLenti6/v5-EGFP-H1-LR-sh7 慢病毒載體包裝病毒后感染HeLa 細胞，篩選得到穩定表達LR shRNA 的2 組共34 株HeLa-LR-sh6 和HeLa-LR-sh7 細胞，熒光顯微鏡下幾乎全部細胞均發出綠色熒光（圖4）。

2.4 HeLa-LR-shRNA 細胞株中LR的抑制效果

對2組共34株細胞培養2 d后提取總RNA和蛋白，進行real-time PCR 和Western 印跡，分別在轉錄水平和蛋白水平檢測HeLa細胞中LR 的表達。realtime PCR 結果顯示34 株細胞中有14 株LR 的表達受到明顯抑制，LR-sh6 和LR-sh7 在RNA 水平上都表現出了較好的LR 抑制作用，LR-sh7 的抑制效率最高可達90%（圖5）。Western 印跡顯示穩定表達shRNA的細胞中LR的蛋白水平明顯下降（圖6、7）。

3 討論

層黏連蛋白是重要的細胞外基質成分。大量研究表明，LR 參與多種細胞活動，不僅能夠介導病毒和朊蛋白與宿主細胞的相互作用[4-5]，而且與腫瘤細胞的轉移密切相關，通過信號轉導介導細胞之間的識別和組織細胞的衰老過程。

圖3 菌落PCR篩選pLenti6/v5-EGFP-H1-shRNA陽性重組子

圖4 穩定表達LR靶向shRNA的HeLa細胞株

圖5 LR shRNA的抑制效率

圖6 HeLa-LR-sh6細胞LR蛋白的表達

圖7 HeLa-LR-sh7細胞LR蛋白的表達

研究表明，LR 的表達水平與很多腫瘤特別是上皮細胞腫瘤的惡性程度有關。在卵巢癌、肺癌及結腸癌中都發現LR 的表達與腫瘤的發展階段呈正相關。Yow 等[6]的研究結果顯示，結腸癌中LR mRNA水平比鄰近的正常結腸上皮細胞高出近9 倍。在乳腺癌[7]、肝癌[8]中，LR 的高表達增強了腫瘤的局部浸潤和淋巴結轉移能力。Berno等[9]針對乳腺癌細胞轉移的研究表明，LR 可通過調控肌動蛋白組裝，影響細胞的黏附和遷移，同時伴隨蛋白水解酶的活化。Horwitz等的研究結果則顯示，LR與細胞外基質相互作用影響腫瘤細胞的信號轉導，可引起ERK、JNK 和p38MAPK的活化，從而影響腫瘤細胞的轉移。

為了深入研究LR在腫瘤轉移中的作用機制，我們設計了靶向LR 的shRNA，并構建了慢病毒載體。慢病毒載體可將shRNA 整合到宿主細胞的基因組中，通過篩選獲得了穩定表達shRNA 的HeLa 細胞，檢測發現內源性LR 在轉錄和蛋白水平的表達被沉默，而且抑制效果顯著。此細胞模型的建立，為體外研究LR 的生物學功能，尤其是LR 在腫瘤轉移中的作用機制提供了有力的實驗工具。

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