TBK1 通過增強雌激素受體α的轉錄活性參與乳腺癌發生的分子機制

郝欽芳，鄒德勇，張麗萍，張小麗，葛曉幸，楊曉莉

武警總醫院 檢驗科，北京 100039

IKK 相關激酶是最近發現的功能和IKK（inhibitor of NF-κB kinase）相近的激酶，包括TANK 結合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和IKKi（又稱為IKKε），均為絲氨酸激酶[1]。TBK1包含729個氨基酸殘基，其N 端1～290 位有一個激酶結構域，在激酶結構域之后的299～383 位之間存在一個泛素樣結構域（ubiquitin-like domain，ULD），此外在603～650位及679～712 位包含2 個螺旋-環-螺旋（helix-loophelix，HLH）結構域。激酶結構域是TBK1 發揮其絲氨酸磷酸化的重要結構域，而ULD 則與其激酶活性、與底物結合相關[2]。TBK1 幾乎在所有組織中穩定表達，Northern 印跡分析表明，TBK1 在胃、小腸、肺、皮膚、腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、胸腺等器官中廣泛表達[3]。

雌激素受體（estrogen receptors，ER）包括ERα和ERβ，它們都屬于核受體超家族[4]。ER 能夠激活含有雌激素應答元件（estrogen responsive element，ERE）基因的轉錄，從而引起細胞的惡性轉化[5]。ERα在乳腺癌的發生發展過程中起關鍵作用。研究表明，ERα的磷酸化可以影響其轉錄激活活性[6]。ERα磷酸化可影響ERα與DNA 和配體的結合能力以及ERα的穩定性，進而影響其轉錄激活功能活性。ERα的Tyr537的磷酸化可調節ERα的二聚體化和DNA 結合能力，Ser118磷酸化可調節ERα的轉錄激活功能。用定向性位點突變試驗檢測ERα磷酸化后的活性，發現Ser118突變為Ala 后ERα的活性降低約25%，但與Ser104、Ser106同時突變時ERα活性可降低50%[7]。總之,這些研究表明ERα的磷酸化影響其轉錄激活活性。

因為TBK1 具有激酶活性，而ERα又受磷酸化調控，我們推測TBK1 可能參與調控ERα。在本研究中，我們在細胞體系中過表達TBK1，發現其可以增強ERα的轉錄活性，而這與TBK1 在先天免疫途徑中的功能無關，而且TBK1 可以通過磷酸化ERα Ser305位調控其下游相關基因的表達。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T、MCF-7 細胞購自中國科學院上海細胞庫；大腸桿菌DH5α感受態菌株購自北京天根生化科技有限公司；Flag-ERα及其突變體、HA-ERα以及ERE-Luc 由軍事醫學科學院生物工程研究所葉棋濃研究員惠贈；Flag-TBK1 和HA-TBK1 及其突變體由本室構建；抗Tubulin、抗Flag 購自Sigma 公司；HRP標記的羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗購自中杉金橋生物科技公司。

1.2 轉染質粒的制備

將新鮮的質粒轉化菌液接種至5～8 mL 含有抗生素的LB 培養基中，37℃、200 r/min 過夜培養16～18 h，用天根公司的普通小提質粒試劑盒提取質粒，用分光光度計測定質粒的D260nm和D280nm值，計算質粒濃度，并依據D260nm/D280nm比值判斷所提質粒的純度。

1.3 細胞培養、傳代和轉染

細胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，在含5% CO2的恒溫孵育箱中培養，采用胰酶消化法傳代。傳代時先吸去培養基，加入PBS清洗細胞；加入1 mL 胰酶消化液，輕輕搖動培養皿，使胰酶消化液覆蓋細胞表面，室溫放置3～5 min（根據不同細胞）；之后加入3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，吹打細胞并形成細胞懸液；將細胞加入15 mL 離心管中，1000 r/min 離心至管底，用新鮮DMEM 培養基重懸細胞，并加入新的細胞培養皿中繼續培養。凍存細胞株時，先用胰蛋白酶消化細胞，同上將細胞離心至15 mL 離心管底部，用含10%二甲基亞砜（DMSO）、20%胎牛血清、70% DMEM 培養基的凍存液重懸細胞，之后將含有細胞的凍存液分裝至細胞凍存管中，做好標記，先置于-70℃過夜，次日取出并投入液氮罐中保存。

利用轉染試劑進行細胞轉染。6 cm 培養皿中細胞生長至60%～80%匯合度時進行轉染。轉染前1 h 更換2 mL 新鮮的DMEM 培養基，將1 μg 質粒和2 μL 脂質體分別用生理鹽水稀釋，混勻后靜置5 min，將含有脂質體的稀釋液逐滴加至含有質粒的稀釋液中，混合后室溫放置15～20 min，使質粒與脂質體形成復合物，之后加入細胞中，輕輕晃動培養皿使之混勻，繼續培養4～6 h 后更換新鮮培養基，24～48 h后收集細胞。

1.4 螢光素酶報告基因檢測

用12孔細胞培養板培養細胞，轉染24 h后將待測細胞中的培養基吸去，每孔加入1 mL PBS 漂洗細胞，之后每孔加入100 μL 1×裂解緩沖液（Promega公司），將12孔板置于搖床中，室溫裂解10 min后12 000 r/min 離心1 min，將上清轉移至新管中；將40 μL 細胞裂解液加入新試管中，之后在管中加入50 μL 螢光素酶檢測試劑（LAR），混勻后用螢光光度檢測儀檢測發光值（如果所測得數值不在量程之內，則須調節螢光光度計的靈敏度），然后加入50 μL 反應終止液，并測定海腎螢光素酶的發光值作為內參，兩者的比值即為螢光素酶的活性。

1.5 免疫印跡實驗

將收集的細胞在4℃預冷的離心機中2000 r/min 離心5 min，棄盡上清；用1 mL 預冷的1×PBS 洗滌細胞2 次，吸盡PBS；加入凝膠上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min，離心后進行SDS-PAGE，電壓為80～120 V，具體操作參照《分子克隆實驗指南》（第3版）。

將PVDF 膜在甲醇中浸泡30 s，之后與2 張2.5 mm厚的濾紙在半干轉移緩沖液中浸泡；將電泳結束后的SDS-PAGE 膠浸入半干轉移緩沖液中，自下而上按照濾紙-膠-膜-濾紙的順序放置在半干轉移儀（Bio-Rad 公司）的2 塊電極之間，盡量趕盡膠和PVDF 膜之間的氣泡；設置轉移電壓18 V，轉移時間1.5 h；轉移結束后將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的1×TBST 緩沖液中封閉1 h，之后用含1×TBST 或含5%脫脂奶粉的1×TBST，或者直接用1×PBST 配制的抗體（一抗）室溫孵育PVDF膜1 h或過夜孵育，結束后用TBST 洗3次，每次5～10 min；一抗孵育結束后，按需加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體（二抗），室溫孵育1 h，用同上方法洗膜；每種抗體孵育結束后回收抗體，進行化學發光，用X線膠片曝光。

1.6 細胞總RNA的提取及RT-PCR

由于RNase極易造成污染，故首先應當用DEPC浸泡處理所有容器以去除RNase。各種槍頭和EP管均使用無RNase產品（Axygen公司）。

用10 cm 細胞培養皿培養細胞，待細胞鋪滿后提取總RNA。首先吸去培養基，用PBS清洗細胞，加入1 mL TRIzol 試劑（Invitrogen 公司）處理細胞，將所有液體轉移至新的EP 管中，14 000 r/min 離心10 min，將上清轉移至新的EP 管中合并，加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s 后靜置3 min，在預冷的離心機中離心15 min，小心吸取上層水相至新的EP管中，在收集的液體中加入0.5 mL 異丙醇，-20℃低溫冰箱中放置10 min（可在冰箱中長期保存）使RNA析出，離心10 min，小心倒去上清，用DEPC 水配制的75%乙醇洗滌，14 000 r/min離心5 min后棄盡上清，在無RNase 的通風櫥中干燥，但不能吹得太干，將白色沉淀物在100 μL DEPC 處理過的水中溶解，用分光光度計測量D260nm值，并計算RNA 含量，之后進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察5S、18S、28S 核糖體rRNA條帶，用于判斷提取的RNA的質量。

之后進行反轉錄反應，反應體系包括總RNA 1 μg、oligo（dT）（50 μmol/L）1 μL、RNase 抑制劑1 μL、反轉錄緩沖液5 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、反轉錄酶（M-MLV）0.5 μL，加DEPC 水至25 μL。在PCR 儀中進行RT-PCR 反應，反應程序設置為42℃1 h、95℃5 min。反轉錄得到的cDNA 可用于后續特異性PCR反應。

PCR反應體系包括cDNA模板5 μL，10×PCR 反應緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP 混合物1 μL，上、下游引物各1 μL，普通高效Taq酶（TaKaRa 公司）1 μL，加入去離子水補至50 μL。在PCR 儀上設置反應條件為：95℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 kb/min，循環次數根據不同基因的豐度調整，一般為14～22個循環；最后72℃延伸5 min。利用β-actin引物擴增β-actin，作為內參。qPCR引物見表1。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 TBK1可以增強ERα的轉錄活性

為了研究TBK1 是否能調控ERα的轉錄活性，我們在HEK293T 細胞中瞬時轉染HA-ERα/Flag-TBK1 和ERE-Luc 報告基因（ERα轉錄結合元件，此報告基因的激活表示ERα入核啟動轉錄）及pRL 質粒，選用HA-Vector（vector）/Flag-Vector（Ctrl）作為對照，檢測TBK1 對ERα轉錄活性的影響。實驗結果表明，與陽性對照組Flag-Vector（Ctrl）和HA-ERα相比，共轉Flag-TBK1 和HA-ERα能夠更為顯著地增強ERE 的轉錄活性；而作為陰性對照，共轉HAVector（vector）和Flag-Vector（Ctrl）或共轉HA-Vector（vector）和Flag-TBK1 時則幾乎不能增強ERELuc報告基因的轉錄活性（圖1A）。為了檢測這種轉錄活性增強作用是否具有特異性，是否與雌激素的刺激有關，我們又選擇了能表達內源ERα的乳腺癌細胞系MCF-7，并在體系中加入雌激素（E2）刺激，瞬時轉染Flag-TBK1，選用Flag-Vector（vector）作為對照。實驗結果顯示，在MCF-7 細胞中無論是否加入E2，TBK1都可以增強ERα的轉錄活性，而加入E2后TBK1的激活作用顯著增強（圖1B），說明TBK1對于ERα轉錄活性的增強具有特異性，既是雌激素依賴的，又是雌激素非依賴的。

表1 引物及序列

2.2 TBK1 增強ERα轉錄活性的功能不依賴于其激活先天免疫途徑的功能

為了研究TBK1 增強ERα轉錄活性的功能是否與其激活先天免疫途徑的功能相關，我們首先將Flag-TBK1 或Flag-TBK1（L352A，I353A）突變體（此突變體為實驗室保存，依照文獻報道，會喪失激活先天免疫途徑的功能）分別與IFN-β-Luc、IRF3-Luc、NF-κB-Luc 報告基因及pRL 質粒共轉染HEK293T細胞，同時轉染Flag-Vector（vector）作為陰性對照，24 h后收集細胞檢測熒光素酶活性，并通過Western印跡檢測相關蛋白的表達。結果顯示，野生型TBK1能明顯激活IFN-β、IRF3 和NF-κB，而Flag-Vector（vector）陰性對照和Flag-TBK1（L352A，I353A）突變體幾乎不能激活IFN-β和NF-κB 信號傳導通路（圖2），說明TBK1 的這2 個位點突變后使其喪失了激活先天免疫途徑的功能。

圖1 TBK1增強ERα的轉錄活性

接著，我們在MCF-7 細胞中瞬時轉染Flag-TBK1/Flag-TBK1（L352A，I353A）和ERE-Luc 報告基因及pRL質粒，檢測TBK1及其先天免疫途徑功能缺失突變體對ERα轉錄活性的影響，并用Western印跡檢測各蛋白的表達水平。結果顯示，TBK1（L352A，I353A）與野生型TBK1 一樣，都可以明顯增強ERα的轉錄活性（圖3），說明TBK1 對ERα轉錄活性的激活不依賴于其激活先天免疫途徑的功能。加入TBK1 的抑制劑BX795 后，TBK1 對ERα的激活作用受到明顯抑制證明了TBK1 對ERα的轉錄激活作用。為了探討TBK1 的激酶活性對其激活ERα轉錄活性的功能是否有影響，我們轉入Flag-TBK1（K38A）質粒（激酶活性缺失突變體），檢測其對ERα的轉錄活性是否具有激活作用，發現其對報告基因的激活作用降至野生組的1/2 水平（圖3），說明TBK1 的激酶活性對其激活ERα轉錄活性的功能具有重要作用。

圖2 TBK1（L352A，I353A）不能激活先天免疫途徑

2.3 TBK1通過磷酸化修飾ERα的S305位增強其下游基因的表達

為了進一步證明TBK1 對ERα轉錄活性的激活作用，尋找可能的作用機制，我們將TBK1 與ERα/ERα（S305A）突變體（磷酸化位點突變）共轉HEK293T 細胞，用RT-PCR 實驗檢測ERα下游基因的表達。結果表明，在野生型ERα存在時，TBK1 能夠明顯增強ERα下游基因的表達；在ERα（S305A）突變體存在時，TBK1卻不能增強ERα下游基因的表達（圖4）。野生型ERα下游基因的表達比磷酸化位點突變的ERα（S305A）下游基因的表達水平高（野生型ERα組的cyclin D1表達水平是突變體組的近3倍，Bcl-xL的表達水平是突變體組的近2倍，C3的表達水平是突變體組的近5 倍，c-fos的表達水平是突變體組的3 倍多，c-Myc的表達水平是突變體組的4倍，pS2的表達水平是突變體組的3 倍多，catD的表達水平是突變體組的近4 倍），不但證明了TBK1 對ERα轉錄活性的增強作用，而且證明這種作用是依賴于TBK1對其S305位的磷酸化修飾實現的。

圖3 TBK1（L352A，I353A）能夠激活ERα的轉錄活性

圖4 TBK1通過磷酸化修飾ERα S305位增強其下游基因的表達

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，雌激素在乳腺癌的發生發展中有極其重要的作用。轉錄因子ERα通過與雌激素結合，調控含ERE 基因的表達，因此，ERα在乳腺癌的發生發展過程中起重要作用。本研究的主要發現包括：TBK1可以增強ERα的轉錄活性；將TBK1 進行L352A、I353A 位點突變后，其喪失激活先天免疫途徑功能，但仍然能夠增強ERα的轉錄活性，說明此作用不依賴于其在先天免疫途徑中的功能；TBK1 可以通過磷酸化ERα的S305 位激活ERα，使其入核啟動下游基因的轉錄。這些發現進一步闡明了乳腺癌發生的機制，對乳腺癌的治療和靶向藥物開發具有一定的指導意義。

TBK1中有一個重要的泛素樣結構域，研究發現ULD 對于TBK1 的磷酸化活性以及其和下游磷酸化底物的結合有著重要的作用[1]。當TBK1 的ULD 被突變之后，TBK1 就失去了與下游激酶底物IRF3 及IκBα結合的能力，從而失去激活下游Ⅰ型干擾素分泌及NF-κB 信號通路的功能。我們將ULD 中重要的352 位Leu 和353 位Ile 都突變為Ala，發現突變體組相比野生型TBK1組幾乎不能激活IFNβ及NF-κB信號傳導通路，但依然能夠激活ERα的轉錄活性，這就表明TBK1 參與ERα信號通路并不依賴于其對NF-κB 通路及IFN-β通路的激活，這些研究初步闡明了先天性免疫信號通路和乳腺癌發生之間的關系。

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