人VHL 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

李玲 ，王婷，梁迎春，張立，馮瀅瀅，周麗英，冀全博，郭靖，徐小潔，葉棋濃

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；2.陜西省婦幼保健院 輔助生殖中心，陜西 西安 710003；3.總參警衛(wèi)局 衛(wèi)生保健處，北京 100017

von Hippel-Lindau（VHL）病是臨床十分罕見(jiàn)的家族性常染色體顯性遺傳性腫瘤病，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管母細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、散發(fā)性腎透明細(xì)胞癌等[1-2]。1993 年，Latif 等將VHL基因定位于染色體3p25-26，并首次克隆了該基因[3]。VHL基因?yàn)橐职┗颍摶虻氖Щ顣?huì)導(dǎo)致正常VHL 蛋白合成障礙，這與肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺導(dǎo)管癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[4-6]。例如，VHLE3 泛素連接酶復(fù)合物能誘導(dǎo)癌細(xì)胞G1 期停止,減少周期蛋白D1 及雌激素受體（ER）的表達(dá)，抑制雌激素依賴型乳腺癌細(xì)胞增殖[5]。

本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建帶Myc 標(biāo)簽的VHL真核表達(dá)載體，以肝癌和乳腺癌2種細(xì)胞系進(jìn)行VHL功能驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究VHL 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌ZR75-1 細(xì)胞系、人肝癌HepG2 細(xì)胞系、人胚腎293T 細(xì)胞系由本室傳代培養(yǎng)；人乳腺文庫(kù)、pXJ-40-myc 載體為本室保存；PCR 試劑、限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購(gòu)自Promega 公司；VigoFect 為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清、DMEM 購(gòu)自Gibco 公司。引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 myc-VHL重組質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序

以人乳腺文庫(kù)為模板，根據(jù)GenBank 中的人源VHL序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGCCCC GGAGGGCGGAGAA-3'）和下游引物（5'-CCGCTC GAGTCAATCTCCCATCCGTTGATGTG-3'），PCR 法擴(kuò)增人VHL的編碼序列（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延長(zhǎng)7 min）。

將PCR 產(chǎn)物行12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，若條帶特異且位置正確，則膠回收PCR 產(chǎn)物后用BamHⅠ/XhoⅠ酶切，形成帶粘性末端的雙鏈；BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pXJ-40-myc 載體，膠回收載體的大片段；將PCR 產(chǎn)物酶切片段用T4DNA 連接酶連接入pXJ-40-myc載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)后，挑克隆進(jìn)行菌液PCR，選取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，再用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定；將酶切鑒定正確的克隆送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞和Western印跡檢測(cè)

用含1%雙抗及10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將人胚腎293T細(xì)胞接種于2個(gè)6 cm 皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)70%～80%的細(xì)胞密度為宜，轉(zhuǎn)染前1 h換液；將4μL VigoFect 與200μL NaCl 混 合，靜 置5 min，期間將10μg 重組質(zhì)粒與200μL NaCl 混合，然后將上述2 種溶液混勻，室溫靜置15 min 后加入6 cm 皿中；以同種方法轉(zhuǎn)染pXJ-40-myc 載體作為對(duì)照。37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，4～6 h 后換液；24 h后收細(xì)胞，3000 r/min 離心5 min，棄上清，加入2 倍細(xì)胞量的RIPA，于冰上裂解30 min，再加入等量2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮15 min，12 000 r/min 離心2 min后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000 稀釋的用HRP 標(biāo)記的抗myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體，室溫下輕搖1 h，用1×TBST 洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色10 min，壓片顯影。

1.4 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

用pXJ-40-myc、5 及10μg 的myc-VHL 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染ZR75-1、HepG2 細(xì)胞，24 h 后各以每孔3000個(gè)細(xì)胞的密度接種于5 塊96 孔板，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，分別在第0、1、2、3、4 d 加入10μL CCK8 后37℃孵育1 h，測(cè)定D450nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸、D450nm平均值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。另收集鋪種96 孔板后剩余的細(xì)胞進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)VHL的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 myc-VHL重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以本室保存的人乳腺文庫(kù)為模板，PCR 擴(kuò)增人VHL的編碼序列，獲得長(zhǎng)約650 bp 的DNA 片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后的PCR 產(chǎn)物和pXJ-40-myc 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑克隆后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，若獲得與目的條帶650 bp 大小接近（圖2）的克隆，則初步認(rèn)為是帶有人VHL基因的陽(yáng)性重組克隆。將所得陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，可切出2 條長(zhǎng)度分別約為5000和650 bp的條帶，且相應(yīng)的空載體酶切后只見(jiàn)大片段，符合預(yù)期結(jié)果（圖3）。DNA 序列測(cè)定結(jié)果表明，插入的DNA 序列與人VHL基因的編碼序列完全一致（數(shù)據(jù)略）。

圖1 PCR擴(kuò)增人VHL的編碼序列

圖2 重組質(zhì)粒pmyc-VHL的菌液PCR結(jié)果電泳圖譜

2.2 Western 印跡檢測(cè)myc-VHL 在293T 細(xì)胞中的表達(dá)

將構(gòu)建的pmyc-VHL 重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞系，24 h 后提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，Western 印跡檢測(cè)myc-VHL 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后，用myc-HRP 抗體可在相對(duì)分子質(zhì)量約26×103處檢測(cè)到明顯的特異性條帶，而空載體無(wú)條帶（圖4）。

2.3 CCK8法驗(yàn)證myc-VHL抑制腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)

VHL為抑癌基因，我們用5、10μg 量的pmyc-VHL 真核表達(dá)載體及pXJ-40-myc 載體轉(zhuǎn)染乳腺癌ZR75-1、肝癌HepG2 細(xì)胞系（圖5），通過(guò)CCK8 法進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，myc-VHL 能抑制ZR75-1和HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，且轉(zhuǎn)染劑量愈大，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用愈明顯（圖6）。

3 討論

圖3 重組質(zhì)粒myc-VHL的BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)

圖5 不同劑量myc-VHL在乳腺癌ZR75-1細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞中的表達(dá)

圖6 VHL抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

VHL基因是抑癌基因，具有典型腫瘤抑制基因的特征，通過(guò)多種途徑抑制腫瘤的形成。其產(chǎn)物VHL與Wnt信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子、氧化磷酸化的調(diào)控有關(guān)。研究表明，VHL通過(guò)參與形成E3泛素連接酶復(fù)合體并與低氧誘導(dǎo)因子（HIF-α）結(jié)合[7-9]；VHL基因失活時(shí)VHL 不能正常表達(dá)，導(dǎo)致HIF 的含量增加，從而使得GLUT-1、VEGF、EPO、TGF-α等細(xì)胞因子表達(dá)，這些細(xì)胞因子廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的能量代謝、血管生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。

目前對(duì)于VHL基因的結(jié)構(gòu)與功能及其調(diào)控途徑的研究已取得重要進(jìn)展，已明確VHL基因的失活機(jī)制主要包括基因突變、雜合性缺失和甲基化，通過(guò)對(duì)VHL基因失活機(jī)制的研究，有助于篩選用于腫瘤早期診斷與預(yù)后的新分子標(biāo)志物。如Volker 等[12]發(fā)現(xiàn)肝臟VHL基因缺失后肝組織嚴(yán)重變性；Kong 等[13]發(fā)現(xiàn)miRNA-155 通過(guò)靶向VHL促進(jìn)腫瘤血管生成，并與三陰性乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)。但目前的VHL研究還不夠全面，例如上調(diào)VHL基因表達(dá)是否能夠預(yù)防和治療腫瘤，還有待于對(duì)其更深入的探討。

綜上所述，我們構(gòu)建的myc-VHL 重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中獲得表達(dá)，能夠抑制腫瘤細(xì)胞系如乳腺癌、肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)[4,14]。該重組質(zhì)粒的構(gòu)建，為后續(xù)研究VHL 的抑癌機(jī)制，以及從分子水平了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于為腫瘤的早期診斷和特異性治療開(kāi)辟新的途徑。

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