人乳頭瘤病毒的環介導等溫擴增檢測法

羅永富

(湖南中醫藥高等專科學校 基礎醫學部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒的環介導等溫擴增檢測法

羅永富*

(湖南中醫藥高等專科學校 基礎醫學部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是引起尖銳濕疣甚至癌變的病原體。PCR技術檢測病毒DNA序列具有特異、敏感等特點，但對儀器設備及檢測人員技術要求較高，不適合于基層醫療單位臨床實驗室的常規診斷方法。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術針對靶基因6個區域設計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下完成擴增，擴增效果可用凝膠電泳、比濁、染色等多種方法檢測，具有反應時間短、肉眼可判斷結果和不需要PCR儀等優點。國內外利用LAMP技術檢測HPV的方法研究偶有報道[1-2]，但針對HPV-6和HPV-11成功的方法研究未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本來源：10例標本均取自邵陽醫專附屬醫院基因診斷室。在告知患者并征得同意的情況下由門診醫生用棉拭子在患者外陰部疑似病灶部位涂抹，置于裝有1 mL無菌0.9%氯化鈉注射液的試管中送檢。其中6例經熒光PCR驗證為HPV病毒陽性臨床標本；2例沙眼衣原體陽性標本和2例解脲支原體陽性標本作為LAMP檢測HPV病毒的陰性對照。

1.1.2 試劑：限制性內切酶(Promega公司)；Betaine(Fluka公司)；Bst DNA Polymerase(Biolabs 公司)；100 bp DNA Ladder(BioDev公司)；DNA Maker Ⅰ(天根公司)；dNTP 和Taq plus DNA聚合酶(北京鼎國公司)；病毒DNA提取試劑盒(四川天澤公司)；MgSO4(Sigma公司)；SYBR Green Ⅰ(北京天恩澤基因科技有限公司)；其余試劑為國產分析純。

1.1.3 引物：選取HPV-6E6基因(基因序號：AF092932)的174～381 bp序列和HPV-11E6基因(基因序號：M14119)的129～306 bp區域序列，用專用引物軟件(Primer Explorer V4)分別設計HPV-6與HPV-11正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內引物(FIP)和反向內引物(BIP)4條，引物由廣州英駿公司合成。……