hsa-mir-615過表達胰腺癌穩定細胞亞系的構建及功能初步驗證

孫 洋，張婷婷，王翠萍，陳 杰*，趙 紅

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協和醫院 病理科；3.北京積水潭醫院 病理科, 北京 100730)

hsa-mir-615過表達胰腺癌穩定細胞亞系的構建及功能初步驗證

孫 洋1,2，張婷婷2,3，王翠萍2，陳 杰2*，趙 紅1

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協和醫院 病理科；3.北京積水潭醫院 病理科, 北京 100730)

慢病毒(Lentivirus)載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達[1]。本實驗在對胰腺癌差異表達的microRNA進行研究時發現hsa-mir-615在胰腺癌組織和胰腺正常導管上皮組織中呈現差異表達[2]，異常表達的microRNA可能具有生物學功能。因此，本實驗構建hsa-mir-615過表達慢病毒載體并包裝成慢病毒，感染人胰腺癌細胞MIA PaCa-2，建立hsa-mir-615過表達穩定細胞系，使用CCK-8法觀察hsa-mir-615對胰腺癌細胞系生長的影響，為進一步研究hsa-mir-615的生物功能構建細胞模型。

1材料與方法

1.1 細胞系及包裝病毒：胰腺癌細胞系MIA PaCa-2(American type culture collection，ATCC)。慢病毒包裝細胞系為人類胚腎上皮細胞系293T細胞(中國醫學科學院北京協和醫院分子病理實驗室保存)。慢病毒包裝采用羅氏LV系統(Tronolab公司)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Lenti-GFP-RNAi四質粒系統組成。

1.2 主要試劑及引物：RNA提取、反轉錄合成cDNA、qPCR及hsa-mir-615表達檢測試劑盒(曠博公司)(Cat.0960602， Cat. 0960401，Cat. 0960211及Cat.0960302)。內切酶及連接酶(NEB公司產品)。轉染使用羅氏FuGENE? HD轉染試劑。

根據genbank及mirbase數據庫[3]獲取基因hsa-mir-615(Gene ID: 693200)序列，設計擴增引物：mir-615-F:5′-CTGT GTGCGCCCAAATTTACGACG-3′，mir-615-R:5′-CGGAATTC AGGGGTGAATAGCTTGCAGCGTTCC-3′

1.3 hsa-mir-615過表達慢病毒制備：采用PCR技術，以含有has-mir-615基因前體的人基因組DNA為模板擴增目的基因，連接入Lenti-GFP-RNAi載體后，轉化入DH5α培養。……