黑桫欏葉中總黃酮含量的測定

趙則海

（肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061）

黑桫欏(Alsophila podophylla Hook.)屬桫欏科(Cyatheaceae)桫欏屬(Alsophila)黑桫欏亞屬(Subgenus Gymnosphaera)[1]，是孑遺植物中瀕危蕨類植物的代表之一[2].桫欏植物含有黃酮類、甾體及三萜類、生物堿、酚類、蛋白質類等多種活性物質[3]，對許多疾病具有明顯的療效[4].近年來，有學者采用大孔樹脂吸附法研究了桫欏（Alsophila spinulosa(Hook.)Tryon）葉總黃酮提取純化工藝[5]，而涉及黑桫欏葉總黃酮測定的研究尚未見報道.本實驗采用分光光度法對黑桫欏葉總黃酮含量進行了測定，并對溝底和山坡采樣樣品中的總黃酮含量進行了比較.

1 儀器與試劑

本實驗所用儀器如下：722型可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；SK8200H型超聲波清洗器（頻率59 kHz，功率500 W），上海科導超聲儀器有限公司；AE240S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司.本實驗所用試劑如下：蘆丁對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、甲醇、乙醇、丙酮等試劑均為分析純.

2 材料與方法

2.1 實驗材料

在廣東省肇慶鼎湖山和九龍湖，分別從溝底和山坡按生長條件采集樣品；黑桫欏葉復葉按嫩葉、成熟葉、老葉采集；每個復葉按葉片和復葉柄分別烘干粉碎備用.

2.2 對照品溶液的制備

在105 ℃的溫度下烘干蘆丁對照品至恒重，精確稱取蘆丁對照品4.82 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，作為標準品溶液，質量濃度為0.482 g/L.

2.3 供試樣品溶液制備

將干燥的黑桫欏粉末用孔徑0.2 mm的篩子過濾，精密稱取約0.1 g置于10 mL容量瓶中，加入體積分數為60%的乙醇，超聲提取1 h，定容至10 mL，作為供試品溶液[6].

2.4 標準曲線建立

精確吸取對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加蒸餾水至2 mL；加質量分數為5%的亞硝酸鈉試液0.4 mL，放置6 min；加質量分數為10%的硝酸鋁試液0.4 mL，放置6 min；加質量分數為5%的氫氧化鈉試液4 mL，加水定容，搖勻，放置15 min；于510 nm處測定吸光度.以濃度（C）與吸光度（A）進行直線回歸，得回歸方程為C=10.147A+0.009 5，R2=0.999 1.

2.5 樣品的測定

吸取供試樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按標準曲線步驟操作，于510 nm處測定吸光度，計算其總黃酮的質量分數：總黃酮的質量分數=(濃度×定容體積/樣品量)×100.

3 測定結果

3.1 黑桫欏葉片總黃酮的提取條件

1）超聲提取時間.以體積分數為60%的乙醇為提取劑，在超聲功率不變的條件下，隨著超聲時間的增加，黑桫欏葉片中總黃酮含量升高，見圖1.超聲提取60 min后，總黃酮含量增長緩慢，由此將超聲提取60 min作為提取條件.

2）不同濃度提取劑對總黃酮含量的影響.黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機溶劑中，其中乙醇和甲醇是常用的提取溶劑[7].用不同濃度的乙醇、甲醇、丙酮提取劑對黑桫欏葉片中總黃酮進行1 h超聲提取，其中體積分數為60%的乙醇和甲醇的提取效果較好，見圖2.高濃度的乙醇、甲醇及丙酮提取液顏色呈綠色或墨綠色，受葉綠素的影響較大.體積分數為60%的乙醇黑桫欏提取液呈現淡黃色或淡綠色，具有很好的透光性.

圖1 超聲提取時間對黑桫欏葉片總黃酮含量的影響

圖2 不同濃度提取劑對黑桫欏葉片中總黃酮提取效果的影響

3）料液比對黑桫欏總黃酮提取效果的影響.黑桫欏葉片總黃酮的提取隨著提取溶劑量的增加而增加.由圖3可見，料液比在1:50～1:100之間增幅較小.溶劑用量少時，提取不完全，用量過多則會造成浪費，所以黑桫欏葉片總黃酮提取的最佳料液比為1:50.

3.2 黑桫欏葉中不同部位總黃酮含量比較

山坡上采集的黑桫欏葉總黃酮的質量分數平均為4.625%，葉片平均為5.672%，復葉柄平均為3.577%；溝底采集的黑桫欏葉總黃酮的質量分數平均為3.303%，葉片平均為3.582%，復葉柄平均為3.025%（見表1）.黑桫欏葉片總黃酮的質量分數為嫩葉>成熟葉>老葉；復葉柄總黃酮的質量分數為成熟葉>老葉>嫩葉.山坡上的黑桫欏葉總黃酮的質量分數高于溝底.

圖3 不同料液比對黑桫欏葉片總黃酮提取效果的影響

表1 黑桫欏葉不同部位總黃酮的含量

4 討論

黑桫欏是受國家重點保護的瀕危植物，因而不能采集其莖和根.本實驗以黑桫欏葉片為原料進行總黃酮測定.現有文獻中未見有關黑桫欏總黃酮測定的報道，通過超聲提取及分光光度法測定黑桫欏中總黃酮的含量，為黑桫欏的可持續開發利用提供了依據.甲醇和乙醇均可作為黑桫欏總黃酮的提取溶劑.體積分數為60%的乙醇是提取黑桫欏總黃酮安全、有效的溶劑.1:50的液料比，超聲60 min，對黑桫欏總黃酮的提取效果較好.溝底生境較為適宜黑桫欏生長，而生長于山坡的黑桫欏葉中總黃酮含量升高，可能與其受到環境脅迫有關.黑桫欏葉中總黃酮含量較高（山坡和溝底總黃酮的質量分數分別為3.303%和4.625%），甚至老葉中總黃酮的質量分數也達到3.0%以上.研究黑桫欏黃酮類物質，對科學、合理地保護、利用黑桫欏資源具有重要意義.

[1]蘇應娟,王艇,鄭博,等.根據cpDNA trnL-F非編碼區序列變異分析黑桫欏海南和廣東種群的遺傳結構與系統地理[J].生態學報,2004,24(5):914-919.

[2]張麗兵,張憲春.中國植物志:第6卷第3分冊[M].北京:科學出版社,2000:265-267.

[3]陳封政,李書華,向清祥.瀕危植物桫欏不同部位化學組分的比較研究[J].安徽農業科學,2006,34(15):3 710-3 711.

[4]戴錫玲,李新國,張瑩.藥用蕨類植物資源研究及其開發利用[J].資源開發與市場,2003,19(6):397-399.

[5]陳封政,李書華,向清祥.桫欏葉總黃酮正交提取工藝和大孔樹脂吸附分離特性的研究[J].中成藥,2008,30(11):1 600-1 604.

[6]曹建國,趙則海,李慶勇,等.刺五加丁香苷和總黃酮含量及其季節動態[J].植物學通報,2006,23(3):269-274.

[7]趙兵,王玉春,歐陽藩,等.超聲波在植物提取中的應用[J].中草藥,1999,30(9):1-3.