長春新堿對人骨肉瘤細胞的效應及其作用機制研究

婁 楠，王 洋，劉國雄，黃嵐峰

（1.深圳市龍華新區人民醫院，廣東 深圳518109；2.深圳市人民醫院；3.吉林大學第二醫院）

骨肉瘤的發病率近年來呈快速增長的趨勢，并且日益年輕化，骨肉瘤的惡性程度高，進展快，化療或放療效果欠佳，數月內即可出現肺部轉移預后較差[1]。尋找行而有效的骨肉瘤治療方案仍是目前研究的焦點。建立骨肉瘤細胞系是對骨肉瘤生物學特性的深入研究的好辦法。長春新堿（vincristine VCR）是一類二聚吲哚類生物堿，在治療惡性腫瘤方面具有顯著的療效，迄今為止仍是主要的抗腫瘤藥物之一[2－4]，但其對骨肉瘤的應用研究尚不明確。因此本文以原代培養建立的骨肉瘤細胞系HOS細胞作為體外實驗的研究模型，分析VCR對細胞的增殖和凋亡的作用規律；檢測VCR對細胞內JunB及c－Jun基因表達的影響，進而闡述藥物作用的分子機理。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑RPMI－1640培養液 （Gibico USA），優等胎牛血清（Hyclone USA），CCK－8細胞活性檢測試劑盒及Hoechest 33342細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），胰酶 （Promega USA），RNase free DNase I（Promega），Total RNA提取試劑盒（Invitr－ogen），實時熒光定量PCR試劑（ABI公司），RT－PCR試劑盒（TaKaRa），PCR引物由TaKaRa公司合成，長春新堿（哈爾濱醫大藥業有限公司）。

1.2 HOS的細胞培養及處理 標本離體后3h進行培養在無菌條件下將瘤組織置于培養皿中，先用Hanks液沖洗幾次，然后去除結締組織和壞死組織，將瘤組織剪成1－1.5mm3大小的組織塊，再將剪碎的組織放在不銹鋼網上（200目孔徑），用Hanks液洗去紅細胞及組織碎片，用貼壁方法將組織塊接種于培養瓶內，瓶底朝上，同時加入含20%小牛血清及青、鏈霉素各100g／ml的RPMI－1640培養液4ml中，置37℃培養箱內，90min后待組織塊粘貼瓶壁，再輕輕將培養瓶翻轉，使組織塊完全浸沒于培養液中培養。將指數增長期的HOS細胞以106個的密度接種于6cm培養皿中，繼續培養24 h，待細胞穩定生長后，分別加入0、5、10、20、50、100 μg.L－1不同濃度的VCR溶液，繼續培養24h，進行下述檢測。

1.3 細胞生長曲線的繪制 將指數生長期細胞接種于96孔培養板中，每孔接種1×103個細胞，分別標記不同的實驗分組，每組設6個平行孔。于5%CO2、飽和濕度、37℃條件下在細胞孵育箱內進行培養24h，再向孔板中加入10μl的細胞活性檢測試劑CCK－8溶液，孵育2h，然后測定490nm吸光度，進而繪制細胞的生長曲線。

1.4 凋亡的觀察 將細胞置于1.5mL的EP管中，用緩沖溶液PBS清洗3次，以去除培養基殘留，并加入相應濃度的凋亡檢測試劑Hoechst33342，繼續孵育30min后PS清洗3次，于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 相關mRNA表達水平的檢測 按商品說明書進行總RNA的提取，對RNA進行RNase free DNase I處理，并將RNA逆轉錄為cDNA均。PCR引物序列：JunB上游引物，5’－CAG GCT ACC CCA ATG ATC C－3’；下 游 引 物，5’－CTT CCG CCT CTT TCT CCA GG－3’。GADD45上游引物，5’－GAG AGC AGA AGA CCG AAA GGA－3’；下游引物，5’－TGC TCC AGT AGT CTT TCA GGG AA－3’。內 參 RPL－13 上 游 引 物，5’－CGA GTT GGC TGG AAG TAC C－3’；下游引物，CTT CTG GCC TGT TTC CGT AG－3’。按照試劑盒說明書要求進行PCR反應。其相關程序為：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min；95℃、15s，60℃、30 s，95℃、15s，40個循環。經融解曲線證實PCR反應產物的特異性。將檢測到的實驗組的Ct值，與內參的Ct值進行比較，兩者的差值即為該實驗組的△Ct值，即實驗組△Ct值＝實驗組Ct值－內參組Ct值。同理可知對照組△Ct值＝實驗對照組Ct值－內參對照組Ct值。通過實驗組△Ct值與對照組△Ct值的比較，得出實驗組各濃度的△△Ct值＝實驗組△Ct值－對照組△Ct值。最后通過2（－△△Ct）來定量基因表達的改變。

1.6 統計學分析 采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，結果以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 VCR改變HOS細胞增殖率 將濃度分別為1、2、5、10、20、50和100μg.L－1的 VCR 作用于HOS細胞24h后，我們可以發現，濃度為5μg.L－1時VCR可明確減低HOS細胞的增殖率（P＜0.05），且呈明確的劑量－效應關系，即隨著濃度的增加抑制作用更顯著（圖1）。

2.2 VCR對HOS細胞凋亡的影響 將HOS細胞經凋亡檢測試劑Hoechst33342染色，來直觀反映VCR的效應。我們發現，活細胞胞核不染色或呈均勻淡染的藍色，核形態良好，而凋亡細胞胞核固縮，濃染，呈現較明亮的著色區。對照組內細胞均為活細胞，罕有凋亡細胞；而VCR作用后出現較多典型的凋亡細胞。

圖1 VCR可顯著抑制HOS細胞增殖

2.3 VCR改變了HOS細胞相關基因的表達 VCR在5和20μg.L－1濃度，JunB的mRNA表達量顯著減少（P＜0.05），分別為對照組的（47.42±9.12）%和（19.07±10.97）%，呈顯著的劑量效應關系；而GADD45的mRNA表達量顯著上調（P＜0.05），分別為對照組的0.95±0.07倍和2.45±0.09倍，呈明顯的濃度依賴關系。結果表明VCR可以通過下調JunB基因的表達，及上調GADD45基因的表達來抑制HOS細胞增殖并促進其凋亡（圖2）。

圖2 VCR顯著改變HOS細胞內JunB及GADD45的mRNA表達水平

3 討論

VCR具有一定的神經系統毒性以及局部組織刺激作用，這也在某種程度上限制了其大劑量在腫瘤治療方面的臨床應用于[5]。本研究分析了VCR對骨肉瘤HOS細胞的抑制增殖和促進凋亡作用并深入探討了其作用的分子機理。結果發現較低劑量（5μg.L－1）的VCR即可顯著抑制細胞的增殖并促進其凋亡。且這一劑量遠低于機體的中毒劑量（2 mg.kg－1），提示VCR在骨肉瘤化療應用方面具有一定的應用前景，這也為本研究前期實驗所證實[6]。

在細胞增殖的調控方面，JunB可以通過直接激活細胞周期蛋白cyclin A的轉錄來促進成骨細胞和成軟骨細胞生長[7]。在腫瘤發生發展的過程中，JunB的高表達可能起到幫助腫瘤細胞免疫逃脫的作用[8]。本研究結果顯示：VCR濃度為10μg.L－1時即可顯著抑制HOS細胞的增殖（P＜0.05），且呈明確的劑量－效應關系；在5和20μg.L－1長春新堿作用下，MG63細胞內JunB的mRNA表達量均顯著減少（P＜0.05），分別為對照組的47.42±9.12%和19.07±10.97%，呈明顯的濃度依賴關系。表明：VCR可以有效下調HOS細胞內JunB的mRNA表達量，使細胞增殖率顯著降低。這也提示JunB作為一種癌基因，在骨肉瘤的發生發展中起到促進作用，而VCR有效的抗骨肉瘤作用機制之一就是通過抑制細胞內JunB的表達來抑制增殖的。

細胞凋亡是化療藥物殺傷腫瘤細胞的重要機制。GADD45作為生長抑制及DNA損傷誘導基因家族的成員，對細胞凋亡、細胞周期阻滯及DNA修復都具有重要的作用[9，10]。本研究的結果顯示：VCR作用后細胞內開始出現一些散在分布的胞核固縮，濃染，呈現較明亮的著色區的凋亡細胞；GADD45的mRNA表達量顯著上調（P＜0.05），分別為對照組的0.95±0.07倍和2.45±0.09倍，呈明顯的濃度依賴關系。因此我們認為，VCR可以顯著上調HOS細胞內GADD45的mRNA表達量，促進細胞發生凋亡。這也揭示出另一條VCR有效抗骨肉瘤的作用途徑。

綜上所述，VCR在較低濃度即可抑制骨肉瘤HOS細胞的增殖，且遠低于中毒劑量，這就表明其可能應用為骨肉瘤的一線化療藥物；而VCR有效的抗骨肉瘤作用機制之一就是通過抑制細胞內JunB的表達來抑制增殖的；同時VCR又可以顯著上調細胞內抑癌基因GADD45的表達，促進細胞發生凋亡，這也揭示出另一條有效的對抗骨肉瘤的作用途徑。

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