重組人粒細胞集落刺激因子對腦出血后caspase－3表達影響的實驗研究

賈麗君，劉 群，王 偉

（1.解放軍第208醫院 神經內科，吉林 長春130000；2.吉林大學第一醫院 神經內科，吉林 長春130021；3.吉林大學 再生醫學科學研究所，吉林 長春130021）

干細胞和組織工程是一新興知識領域，但在實際臨床工作中，干細胞來源較困難，涉及到移植排斥等難題，且存在有創性操作，使其短期內在腦血管病治療中無法推廣應用。rhG－CSF可動員的骨髓干細胞，克服了干細胞移植中體外培養、分離純化等技術難題，成為腦血管病理想治療方法之一。本實驗通過rhG－CSF對腦出血大鼠干預治療，觀察重組人粒細胞集落刺激因子是否具有神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取3－4月齡的健康Wistar大鼠72只，隨機分組。

1.2 藥物與試劑 重組人粒細胞刺激因子注射液（rhG－CSF）；Trizol試劑；逆轉錄試劑盒；Taq酶；PCR引物；DL－2000Marker；DEPC。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組 隨機分為對照組、治療組和假手術組，ICH模型制備：斷尾取自體血方法。各組各時間點各取6只動物。術后1h開始對治療組腹部皮下注射50μg／（kg·d）重組人粒細胞集落刺激因子，對照組及假手術組均注射等量生理鹽水。取術后1d、3d、7d、14d四個時間點行NSS評分后處死動物，取腦、保存備用于液氮內。

1.3.2 PCR引物 大鼠caspase－3基因序列、引物序列及大鼠β－actin上游引物序列均由上海生工生物技術有限公司合成。腦內總RNA提取按照Trizol試劑盒說明進行。逆轉錄后進行PCR反應。

1.4 統計學處理 兩樣本均數間的t檢驗通過SPSS 15.0統計軟件包進行，結果以±s表示，P＜0.05表示存在統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 對照組和治療組的NSS評分均增高，而假手術組的的NSS評分無明顯變化，術后1d時對照組和治療組評分P＞0.05，無顯著差別，但在其后3個時間點兩組差別顯著（P＜0.05）（表1）。

表1 rhG－CSF對腦出血后NSS評分的影響

2.2 caspase－3基因 RT－PCR的表達

2.2.1 待測caspase－3經 PCR 擴增后，mRNA 表達產物出現在近500bp處，在對照組（見圖1）和治療組（見圖2）中均見有caspase－3mRNA表達，在3 d時兩組均呈高水平表達。

2.2.2 在第三天時與對照組相比，治療組中caspase－3的表達水平明顯降低，說明rhG－CSF可以抑制caspase－3的表達（見圖3）。

圖1 a－c孔為內參照；對照組中caspase－3mRNA的表達

圖2 a－c孔為內參照；治療組中caspase－3mRNA的表達

圖3 對照組及治療組caspase－3mRNA在3d時的表達a－d孔為內參照，5－8孔為對照組，1－4孔為治療組

3 討論

腦出血后引起神經細胞死亡的重要環節是細胞凋亡，這種變化的發生與神經元凋亡相關基因的表達方式密切相關。Caspase－3是細胞凋亡通路的最終效應子，實驗表明減少caspase－3的表達能夠抑制神經元凋亡，達到神經保護效果。本研究結果顯示在腦出血后3d時治療組較對照組均呈高水平表達，治療組較對照組中caspase－3的表達水平下降，具有統計學意義，表明神經系統代償性的自身修復能力有限，rhG－CSF治療可以減輕神經功能缺損，可以有效地抑制神經元的凋亡[1]?，F有文獻表明rhG－CSF的神經保護作用是通過動員骨髓干細胞完成的[2]。骨髓干細胞包括造血干細胞和骨髓間充質干細胞。rhG－CSF治療可以顯著提高外周血中的干細胞數量，使主要位于骨髓中的干細胞通過表皮生長因子、腦源性神經營養因子、血管內皮生長因子及神經生長因子等各種細胞因子的作用[3]，經過血液循環到達受損組織，在腦損傷的病理環境中向著生成神經細胞的方向定向分化[4]，從而達到細胞移殖的目的，是一種新興的、有美好前景的細胞移殖方法。rhG－CSF的神經保護作用機制仍有待于進一步探索，這對腦卒中臨床治療方案的開發具有重要意義。

[1]賈麗君，范 佳，劉 群.重組人粒細胞集落刺激因子對大鼠腦出血后神經功能損傷的保護[J].中國老年學雜志，2010，30（4）：513.

[2]Sevimli S，Setrecker JK，Strazzer，et al.Endogenous brain protection by G－CSF after ischemic stroke[J].Exp Neurol，2009，217（2）：472.

[3]Zavala F，Abad S，Jones NC，et al.G－CSFtherapy of ongoing experimental allergic encephalomyelitis via cytokine－based immune deviation[J].Immunol，2003，154（3）：1032.

[4]Schabitz，cortis，Prior MJ，et al.Neuroprotective effect of G－CSF after cerebral ischemia[J].Stoke，2004，64：533.