酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素檢查方法驗證

嵇海澄??王倜??王春玲??李孝壁

[摘要] 目的 參考USP、EP，探討并建立酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素標準與檢查方法（凝膠法）。 方法 按《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪE細菌內毒素檢查方法進行。 結果 經驗證，酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計），通過稀釋法可消除干擾，無干擾濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。 結論 可按此標準采用本法對本品進行細菌內毒素檢查。

[關鍵詞] 酒石酸長春瑞濱；細菌內毒素檢查方法驗證；凝膠法

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）21-105-03

酒石酸長春瑞濱（vinorelbine tartrate）化學名3，4-二去氫-4-去氧-8-去甲長春堿二酒石酸鹽，屬于長春堿類抑制細胞分裂的抗腫瘤藥物，主要通過抑制微管蛋白的聚合，使細胞分裂停止于有絲分裂中期[1]，是一細胞周期特異性的藥物。臨床上主要與其他抗癌藥物聯合應用于治療非小細胞肺癌，也可用于晚期乳腺癌[2-5]、食管癌等。FDA于1994年批準酒石酸長春瑞濱用于晚期非小細胞肺癌患者的一線治療。無菌檢查、細菌內毒素檢查、微生物限度檢查是藥品安全性檢查的重要項目[6]。

本品制劑為酒石酸長春瑞濱注射液，其國內現行標準為《中國藥典》，明確規定了細菌內毒素檢查的項目與標準[7]。酒石酸長春瑞濱目前國內現行標準為《中國藥典》，現標準中未規定細菌內毒素的控制項目與標準[7]。為更好地控制制劑的細菌內毒素水平，對酒石酸長春瑞濱原料開展建立細菌內毒素檢查標準與方法的研究，參照《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪX M化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則及附錄ⅪE細菌內毒素檢查法[7]、USP（85）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[8]、EP（2.1.6.4）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[9]以及EP8.0中酒石酸長春瑞濱細菌內毒素標準[10]、USP37-NF32中酒石酸長春瑞濱注射液的細菌內毒素標準[11]，建立并驗證本品種的細菌內毒素檢查標準與方法。

1 實驗材料

1.1 儀器

電子分析天平、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱、XW-80A旋渦混合器、DK-600電熱恒溫水槽、HH-2F凈化工作臺。

1.2 試劑

1.2.1 細菌內毒素工作標準品 規格160EU/支，批號150601-201174，中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 鱟試劑 鱟試劑1（λ=0.03EU/mL，規格0.1mL/支，批號1211022，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑2（λ=0.03EU/mL，規格0.1mL/支，批號12060612，福州新北生化工業有限公司）。

1.2.3 細菌內毒素檢查用水WBET 規格50mL/瓶，批號13020315，褔州新北生化工業有限公司。

1.2.4 堿性pH調節劑 規格2mL/支，批號121127，褔州新北生化工業有限公司。

1.2.5 酒石酸長春瑞濱 批號：130701、130702、130901。

2 方法（凝膠法）

2.1 試驗準備

試驗過程所用的移液槍等儀器設備必須經過確認并在有效期內；玻璃、不銹鋼等容器及用具經250℃，至少1h干熱滅菌以去除外源性內毒素；塑料器具須經清洗并確證不干擾試驗結果；所用的標準品、試劑均在有效期內，鱟試劑初次使用前須進行靈敏度復核。

2.2 細菌內毒素限值L

酒石酸長春瑞濱注射液的細菌內毒素標準CP2010、USP37-NF32中分別為按長春瑞濱計，L<6.0EU/mg（CP2010）與L<3.0IU/mg（USP37-NF32）；EP8.0中酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素標準為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計）。綜上所述，本次驗證取L<1.0IU/mg（以長春瑞濱計）。

2.3 鱟試劑靈敏度復核

按《中國藥典》（2010年版）二部附錄ⅪE細菌內毒素檢查法“鱟試劑靈敏度復核試驗”項下規定進行，所用2批鱟試劑的實測靈敏度λc與標示靈敏度λ均一致（0.5λ≤λc≤2.0λ），均符合規定。

2.4 供試品最低有效活性濃度C計算

當最大有效稀釋倍數為1時，相對應的濃度即為最低有效活性濃度（Cp），按Cp=λ/L計算，一般取C>Cp，本次驗證C取0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

2.5 干擾試驗

2.5.1 供試品溶液（NPC）的制備 精密稱取酒石酸長春瑞濱（批號130701）適量，用WBET溶解成含長春瑞濱為10mg/mL的溶液，并用pH調節劑調節pH為6.0～8.0，用WBET稀釋制成濃度為C的供試品溶液。

2.5.2 細菌內毒素內毒素工作標準品溶液（PC）和細菌內毒素供試品溶液（（PPC）制備 用1mL WBET將1支內毒素工作標準品溶解后，在旋渦混合器連續混合15min后，分別用WBET和NPC稀釋成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的PC和PPC。在進行下一步稀釋前，至少混合30s。

2.5.3 干擾試驗過程 取鱟試劑1、2各38支，分別用0.1mL WBET溶解，再分別加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的PC和PPC各0.1mL混和，每一濃度平行做四份。同時用0.1mL WBET平行做2份陰性對照，用0.1mL NPC平行做4份陰性對照。將安瓿中溶液輕輕混勻后封閉管口，垂直放入電熱恒溫水槽中，從放入開始準確記錄時間，在（37±1）℃無振動保溫（60±2）min。試驗結果見表1。

另取130702、130901批酒石酸長春瑞濱同前操作。試驗結果見表2。endprint

從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進行干擾試驗，結果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結果表明，酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

3 結果

對3批酒石酸長春瑞濱進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定。見表3。

4 討論

經試驗，酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計），酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

在本試驗條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認無干擾影響。酒石酸長春瑞深經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢查結果準確可靠。

當細菌內毒素工作標準品、鱟試劑、供試品的生產工藝或試驗環境中發生任何可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應通過加入合適的pH調節劑進行pH調節。

[參考文獻]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

[2] Bryan AF，Trailokya NP.Safety and efficacy of vinorelbine in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Clin Med Insights On-col，2011，5（10）：131-144.

[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 許玉華、杜娟、湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint

從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進行干擾試驗，結果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結果表明，酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

3 結果

對3批酒石酸長春瑞濱進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定。見表3。

4 討論

經試驗，酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計），酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

在本試驗條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認無干擾影響。酒石酸長春瑞深經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢查結果準確可靠。

當細菌內毒素工作標準品、鱟試劑、供試品的生產工藝或試驗環境中發生任何可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應通過加入合適的pH調節劑進行pH調節。

[參考文獻]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

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[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint

從表1、2可見，用兩個廠家的鱟試劑對酒石酸長春瑞濱進行干擾試驗，結果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此結果表明，酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

3 結果

對3批酒石酸長春瑞濱進行細菌內毒素檢查，結果均符合規定。見表3。

4 討論

經試驗，酒石酸長春瑞濱的細菌內毒素限值確定為L<2.0IU/mg（以長春瑞濱計），酒石酸長春瑞濱對細菌內毒素檢查（凝膠法）無干擾的濃度為0.035mg/mL（以長春瑞濱計）。

在本試驗條件下，取3個批號的供試品，用BET水分別按上述方法配制成0.035mg/mL供試品稀釋液，然后用λ=0.03EU/mL的上述兩個廠家的鱟試劑各16支實驗，供試品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范圍之間，確認無干擾影響。酒石酸長春瑞深經過按細菌內毒素檢查法實驗后，確證了本品可以用稀釋方法排除干擾，用細菌內毒素查法（凝膠法）對供試品進行細菌內毒素的檢查結果準確可靠。

當細菌內毒素工作標準品、鱟試劑、供試品的生產工藝或試驗環境中發生任何可能影響試驗結果的變化時，需重新進行干擾試驗。

供試品溶液和鱟試劑混和液的pH值一般在6.0～8.0之間，在檢測前應通過加入合適的pH調節劑進行pH調節。

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[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 許玉華、杜娟、湯楊.藥品微生物污染檢測方法驗證的必要性[J].中國藥品標準，2005，6（4）：46.

[7] 國家藥典委員會編.中國藥典（2010年版）二部[S]北京：中國醫藥科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（歐洲藥品質量委員會）編輯，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention編輯出版，2014年5月1日生效.

[12] 中國藥品生物制品檢定所/中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint