脂聯(lián)素基因多態(tài)性(-11377 C/G，-3964A/G，-45T/G)與腦梗死相關(guān)性研究

相 波， 丁曉潔， 張 磊， 王 超， 王曉青， 潘旭東

脂聯(lián)素(Adiponectin，ADIPOQ)是由脂肪組織特異性分泌的激素蛋白，參與能量代謝、維持血糖、血脂平衡。它具有胰島素超敏化作用，能改善胰島素抵抗［1］;參與炎癥反應(yīng)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在急性腦梗死發(fā)生后的全部病程中ADIPOQ均具有腦保護(hù)作用:超早期可抑制ROS產(chǎn)生減少應(yīng)激損傷［2］;發(fā)病早期可抑制炎癥因子 TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1和黏附分子VCAM-1/ICAM-1的生成減輕缺血后炎癥反應(yīng)［3，4］;修復(fù)期可保護(hù)血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)缺血組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)以刺激血管新生［5］，同時(shí)可誘導(dǎo)缺血組織血管內(nèi)皮eNOS磷酸化，增加血管中NO含量，能擴(kuò)張血管、增加腦血流量、促進(jìn)缺血腦組織功能恢復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)血漿ADIPOQ水平與腦梗死相關(guān)［3，6］。

腦梗死是遺傳和環(huán)境因素共同作用的多基因疾病，實(shí)現(xiàn)在人類全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析從而確定腦梗死的主要致病基因，現(xiàn)階段仍需繼續(xù)探求與腦梗死關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)數(shù)目。研究提示ADIPOQ基因也是腦梗死易感性的候選基因之一［7］，ADIPOQ基因變異與ADIPOQ水平相關(guān)［8］。但是此基因與腦梗死相關(guān)性的研究較少而且研究結(jié)果不一致，目前尚無(wú)關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死易感性的Meta分析。我們?cè)谥袊?guó)北方青島地區(qū)漢族人群中進(jìn)行ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病病因的相關(guān)性研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 (1)腦梗死組:均為2011年3月～2013年1月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的腦梗死患者，共372例，其中男性182例，女性190例。入組標(biāo)準(zhǔn):診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華神經(jīng)科學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的“各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)(1995)”。入選病例均經(jīng)頭部CT和(或)MRI證實(shí)，并且行經(jīng)顱多普勒、顱腦血管超聲、頭部MRA、心臟超聲檢查，部分患者進(jìn)一步行CTA、DSA等檢查明確腦血管和心臟病變情況。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心、肝、腎功能不全;②心源性栓塞、其他病因或不明原因型腦梗死;③繼發(fā)性腦梗死，如嚴(yán)重感染、腦血管畸形/動(dòng)脈瘤、血栓性疾病、腫瘤、血液病、自身免疫性疾病等。(2)對(duì)照組:為同期查體中心的查體者416例，其中男性216例，女性200例，其性別與年齡與腦梗死組相匹配。入組標(biāo)準(zhǔn):既往無(wú)腦梗死病史，頭部CT或MRI證實(shí)無(wú)腦梗死灶。排除標(biāo)準(zhǔn):同病例組。

1.2 臨床數(shù)據(jù)采集 所有入組者均填寫調(diào)查問卷，內(nèi)容包括研究對(duì)象的一般情況(如:姓名、性別、年齡等)、家族史、既往史、吸煙及飲酒史。該研究符合我院所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有入組者均簽署知情同意書。測(cè)量血壓、身高、體重、抽取晨起空腹血檢測(cè)生化指標(biāo)

1.3 SNPs的選擇 從NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)中選取ADIPOQ基因多態(tài)性位點(diǎn)，要求所選位點(diǎn)異型性已知，且其相對(duì)少見的等位基因頻率在亞洲人群中＞0.05，最終選擇 3個(gè)代表性的 SNPs即rs266729、rs822396及rs2241766進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 基因多態(tài)性檢測(cè) 所有受試者均于清晨空腹抽取前臂靜脈血5 ml，EDTA抗凝，常溫下2700 rpm/min離心10 min，收集細(xì)胞層，凍存于-80℃冰箱待用。應(yīng)用血液基因組快速抽提試劑盒(上海生工SK8224)提取DNA。rs266729和rs2241766采用PCR-RFLP鑒定基因多態(tài)性(PCR擴(kuò)增引物和限制性內(nèi)切酶見表1)，分別鑒定出rs266729的3種基因型CC、CG、GG和rs2241766的3種基因型 TT、TG、GG。PCR總反應(yīng)體系10μl:DNA模板100 ng，5 U/μl Taq DNA 擴(kuò)增酶(上海生工 SK2492)0.1 μl，10×PCR Buffer 1 μl，2 mmol/L dNTP Mix 0.8 μl，25 mmol/L MgCl21μl，上、下游引物各1 μl(2 μmol/μl，上海生工合成)，加雙蒸水至10μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3μl PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定，剩余7μl PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶HhaI酶(Thermo scientific ER1851)和 SmaI酶(Thermo scientific ER0661)過夜消化，電泳觀察(150 V 20 min)。隨機(jī)抽取部分標(biāo)本經(jīng)測(cè)序(上海生工完成)鑒定rs266729和rs2241766的基因型，測(cè)序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果完全相符。rs822396位點(diǎn)因未找到天然內(nèi)切酶，采用直接測(cè)序法分析(上海生工完成)，鑒定出AA、AG及GG 3種基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，兩組計(jì)量資料比較采用以t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn);多因素logistic回歸分析進(jìn)行ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SESsis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)進(jìn)行基因分析，基因型和等位基因風(fēng)險(xiǎn)率采用相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio，OR)表示;用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確定樣本是否具有群體代表性。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死組和對(duì)照組一般臨床資料比較腦梗死組和對(duì)照組比較，年齡、性別、飲酒史、總膽固醇、低密度脂蛋白水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表 2)。

2.2 等位基因頻率及基因型分布的比較 3個(gè)SNP的基因型分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。rs266729的基因型分布在腦梗死組和對(duì)照組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);rs822396、rs2241766的基因型分布在腦梗死組和對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.0 5);上述3個(gè)SNP的基因頻率在腦梗死組和對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(見表3)。

2.3 rs266729與腦梗死的相關(guān)性 進(jìn)一步在顯性、隱性、累加這3種模式下分析rs266729與腦梗死的相關(guān)性。在3種模式下，rs266729的基因型分布在腦梗死組和對(duì)照組中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);rs266729 G等位基因變異能增加腦梗死的易感性(3種模式下 OR 值分別為:1.35、2.15、2.33)(見表4)。

2.4 多因素logistic回歸分析 調(diào)整腦梗死危險(xiǎn)因素BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回歸分析結(jié)果示顯性模式下rs266729的基因型分布在腦梗死組和對(duì)照組中仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，GG+GC基因型可增加腦梗死的易感性(OR值=1.44)，G等位基因變異仍是腦梗死的易感危險(xiǎn)因素(見表5)。

2.5 單倍型分析 3個(gè)SNP位點(diǎn)采用SESsis在線軟件(http://analysisbio-x.cn/myAnalysis.php)進(jìn)行連鎖不平衡分析，未發(fā)現(xiàn)存在連鎖不平衡。單倍型頻率均＜0.03。

表1 鑒定rs266729和rs2241766位點(diǎn)的PCR引物及限制性內(nèi)切酶

表2 研究對(duì)象一般臨床資料分析

表3 ADIPOQ基因3個(gè)SNP的基因頻率及基因型分布

表4 rs266729與腦梗死的相關(guān)性

表5 rs266729與腦梗死相關(guān)性的多因素Logistic回歸分析

3 討論

ADIPOQ基因位于染色體3q27上，全長(zhǎng)約17 kb，含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子［9］。大量研究發(fā)現(xiàn)染色體3q27區(qū)域能增加2型糖尿病、代謝綜合征及心血管病變的遺傳易感性［10～12］，但是關(guān)于此區(qū)域與腦梗死發(fā)病易感性關(guān)系的研究較少。因此，我們進(jìn)一步研究位于此區(qū)域的ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病的相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)rs266729在顯性、隱性、累加模式下均與腦梗死有相關(guān)性;在調(diào)整腦梗死的危險(xiǎn)因素BMI(≥24 kg/m2)、吸煙史、收縮壓、甘油三酯、高密度脂蛋白、空腹血糖水平后，多因素logistic回歸分析仍表明在顯性模式下rs266729與腦梗死具有相關(guān)性;GG+GC基因型可增加腦梗死的易感性;等位基因G變異是腦梗死易感的危險(xiǎn)因素。劉芳等［13］認(rèn)為rs266729 GG基因型和G等位基因可增加中國(guó)北方漢族人群腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)性;陳小良等［14］發(fā)現(xiàn)雖然rs266729與北方漢族總體人群腦梗死易感性無(wú)關(guān)，但在女性中GG純合變異增加了腦梗死的易感性。同樣，Yamada等［15］發(fā)現(xiàn)rs266729 GG基因型能增加日本人群中代謝綜合征患者動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)。

上述針對(duì)亞洲人群的研究與本研究結(jié)果一致;但是針對(duì)美國(guó)人群的研究結(jié)果卻相反，Hegener HH［7］等發(fā)現(xiàn)rs266729能降低腦梗死的危險(xiǎn)性，這提示rs266729微小等位基因G變異可能具有種族差異性。

rs266729位于ADIPOQ基因啟動(dòng)子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)其等位基因G與低血漿ADIPOQ水平相關(guān)［16］。在3T3-L1大鼠脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，等位基因G能改變DNA結(jié)合活性從而降低ADIPOQ基因啟動(dòng)子的活性［17］;同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)G基因也能降低轉(zhuǎn)錄因子sp1和啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的親和性［18］。上述因素可引起ADIPOQ基因表達(dá)減少，從而導(dǎo)致血漿ADIPOQ水平減少。低血漿ADIPOQ水平與腦梗死相關(guān)［6］，因此rs266729等位基因G變異能增加腦梗死的易感性。

rs822396位于第2個(gè)內(nèi)含子區(qū)域，Pischon等［19］發(fā)現(xiàn)rs822396 G基因與美國(guó)女性非致命性心肌梗死或致命性冠脈血管病變相關(guān)。My-Young Cheong等［20］研究表明在韓國(guó)人群中此位點(diǎn)與腦梗死相關(guān)，而且包含 rs822396在內(nèi)的由 6個(gè) SNP(rs822396、rs822391、rs182052、rs16861205、rs12495941、rs3776241)組成的單倍型(AGGCGG and AAGTAG)與腦卒中相關(guān)。Hegener HH等［7］針對(duì)美國(guó)人群研究發(fā)現(xiàn)由rs266729/rs182052/rs822396組成的單倍型(GAG)與降低缺血性卒中相關(guān)。國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)rs822396與腦梗死相關(guān)性的研究報(bào)告，本研究首次發(fā)現(xiàn)rs822396在顯性、隱性、累加模式下均與腦梗死無(wú)相關(guān)性。

rs2241766位于第二個(gè)外顯子區(qū)域，等位基因G/T變異為同義變異(GGT-GGG，Gly-Gly)。目前有關(guān)于此位點(diǎn)的研究較多，但結(jié)果差別較明顯。陳小良等［14］研究認(rèn)為rs2241766基因多態(tài)性與中國(guó)北方漢族總體人群腦梗死的易感性相關(guān);但劉芳等［13］針對(duì)中國(guó)北方人群及Hegener HH等［7］針對(duì)美國(guó)人群的研究結(jié)果卻顯示rs2241766與腦梗死不相關(guān)，這與本研究的結(jié)果一致。同樣，不同學(xué)者關(guān)于rs2241766與冠脈血管病變、糖尿病及高血壓病的易感性的研究結(jié)果也不一致［21］。

同連鎖分析相比，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果會(huì)受到研究人群的遺傳背景、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本大小、研究對(duì)象的入選標(biāo)準(zhǔn)等多因素影響，因此有必要針對(duì)不同種族、不同區(qū)域的人群進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究。

目前我們僅在美國(guó)［7］、亞洲［13～15，21］人群中發(fā)現(xiàn)的這幾項(xiàng)關(guān)于ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死易感性的研究，結(jié)果也不一致。雖然尚不清楚ADIPOQ基因確切的遺傳模式，但本研究確實(shí)發(fā)現(xiàn)rs266729 G等位基因變異與增加腦梗死發(fā)病易感性相關(guān)。我們下一步希望重點(diǎn)選取位于連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)的SNP位點(diǎn)及擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究，同時(shí)繼續(xù)深入探討ADIPOQ基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病易感性相關(guān)的機(jī)制。

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