移植BDNF和GDNF基因修飾的hMSCs對大鼠大腦中動脈阻塞的影響*

鐘慧霖， 陳文明， 李翠瑩， 王茜婷， 張靜遠， 蘭 丹， 劉海霞， 鄒清雁△

(1廣州賽吉生物科技有限公司，廣東廣州510633;2廣東三九腦科醫院神經醫學研究中心，廣東廣州510510)

中風是致殘最大誘因，也是第二大致死性疾病［1-2］，在我國每年中風患者有300多萬。傳統治療手段如藥物治療和溶栓治療時間窗短，限制因素多，存在很大的缺陷［3］，因此迫切需要研發新的治療方法。越來越多的研究提示干細胞治療有可能為中風治療提供一種新的方法［4］。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源廣泛，有高分化潛能，免疫原性弱，并且骨髓MSCs能從骨髓遷移到周邊血管最終進入中樞神經系統影響神經損傷［5］，現有報道的作用機制包括神經元替換、分泌細胞因子，對神經有保護和營養支持作用以及抑制炎癥、免疫調節等［6-8］。

不少學者用功能基因修飾人MSCs(human MSCs，hMSCs)用于疾病治療并取得了很好的治療效果。早在2005年，Kurozumi等［9-10］使用腺病毒轉染方法，將腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)或膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)基因轉入MSCs進行腦室移植治療大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠模型，取得了較好的治療效果。然而腺病毒在進行基因治療實驗中曾經有導致患者死亡的報道［11］。

與病毒轉染技術相比，非病毒載體轉染更為安全，有較好的臨床適用性。本研究選擇高效非病毒表達載體，采用脂質體轉染技術將BDNF和GDNF基因轉入hMSCs，獲得高表達的hMSCs，再通過股靜脈注射移植到MCAO大鼠模型體內，觀察hMSCs和高表達BDNF、GDNF的hMSCs聯合移植對MCAO的影響，旨在探索非病毒載體轉染hMSCs的效率及其對MCAO的影響，為腦血管病治療臨床研究提供一種干細胞相關的基因治療方法。

材料和方法

1 動物、細胞和載體

SPF級Wistar大鼠30只(最終納入實驗)，體重270～300 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015。hMSCs由廣東三九腦科醫院神經醫學研究中心提供。質粒pEGFPN2、pCAG-Kan-Neo、pCMV-Neo 和大腸桿菌菌株TOP10由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院惠贈。

2 主要試劑

基因組 DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和DNA回收試劑盒(北京天根生化科技公司);DNA聚合酶和限制性內切酶(TaKaRa);胎牛血清和α-MEM(HyClone);L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、DMSO、Lipofectamine? 2000 transfection reagent和0.05%胰蛋白酶(Invitrogen);G418(Merk);維生素C(vitamin C，Vit C)(Sigma);BDNF和GDNF ELISA試劑盒(RD System)。所用引物由華大基因設計合成。

3 主要方法

3.1 hMSCs的分離培養 從健康成人志愿者體內采集骨髓血，采用我們自行研發的專利分離液分離單個核細胞，加自配改良細胞培養基(89% α-MEM、10%FBS、1%GlutaMAX、0.1% β-巰基乙醇、50 mg/L Vit C、5 ng/L血小板源性生長因子)進行體外培養擴增，傳至第3代做流式細胞術鑒定。經鑒定MSCs純度較高的用于后續基因提取以及細胞轉染。

3.2 載體構建 從原代hMSCs中提取總RNA，再反轉錄成cDNA(方法參照試劑盒說明書)。設計GDNF引物正義鏈 5′-ATGCAGTCTTTGCCTAACAGCAATG-3′，反 義 鏈 5′-TCAGATACATCCACACCTTTTAGCG-3′;BDNF 引 物 正 義 鏈 5′-ATGACCATCCTTTTCCTTACTAT-3′，反義鏈 5′-CTATCTTCCCCTTTTAATGGTC-3′。以此 cDNA為模板進行 PCR克隆BDNF和GDNF并送公司測序與NCBI上序列進行比對(GDNF:AY052832;BDNF:EF674517)，經測序證實序列與GenBank上一致。在BDNF和GDNF基因片段兩端加上合適的酶切位點分別連接到pCAGKan-Neo和 pCMV-Neo上。將構建好的載體轉化TOP10大腸桿菌擴增，提質粒酶切鑒定并送公司測序，比對測序結果，將測序正確無突變克隆的用于擴增轉染細胞。

3.3 質粒擴增、線性化 將質粒pCAG-BDNF、pCMV-GDNF或pEGFP-N2轉化TOP10大腸桿菌，擴增后進行質粒提取，用ApaL I進行酶切線性化，經電泳鑒定確認線性化完全后乙醇沉淀，用無菌水溶解。保證終總量在24 μg以上。

3.4 脂質體轉染細胞 復蘇細胞于10 cm培養皿，長滿后以1∶3傳代至新10 cm培養皿，培養24 h后分別進行pCAG-BDNF、pCMV-GDNF和pEGFP-N2脂質體轉染(方法依照試劑盒說明書)，轉染后4～6 h換液，24 h取上清進行ELISA檢測并以1∶3傳代。在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光表達情況。48 h后加G418(300 mg/L)進行篩選。每2 d換液1次，大約10～15 d長出克隆，然后將克隆細胞傳代擴增，凍存。將ELISA檢測中BDNF和GDNF蛋白表達量高的細胞用于動物實驗。

3.5 動物行為訓練 對所有大鼠(體重約260 g)進行行為學訓練:(1)貼附物移除實驗，將圓形標簽紙(直徑16 mm)貼到大鼠兩前爪，放回籠子，記錄其撕紙時間，大于1 min按1 min計算。每天3次中間間隔10 min以上。(2)轉棒實驗，將大鼠放到疲勞儀轉棒上，設定疲勞儀轉動時間3 min，20 r/min訓練2次，25 r/min訓練2次，30 r/min訓練5次。每天訓練3次，間隔10 min以上。

3.6 制作MCAO模型 將訓練合格的大鼠(12 s內移除貼附物，轉棒儀跑步測序持續170 s以上)制作MCAO模型，方法參照 Kurozumi等［10］的制作方法。24 h后對模型鼠進行功能評分，參照Longa評分并進行改良，具體如下:0分:無神經損傷癥狀;1分:不能完全伸展對側前爪;2分:提尾對側肩內收，身體綣起;3分:提尾放地上向對側轉圈或輕微自發向對側轉圈;4分:向對側傾倒;5分:意識喪失，不能自發行動。選取評分為2～3分的大鼠18只隨機分成3組，每組6只，分別為PBS對照組、hMSCs治療組和轉基因hMSCs治療組。另制作假手術大鼠6只。

3.7 細胞移植前準備 復蘇待移植細胞，培養傳代至細胞足量。移植前用0.05%胰酶消化細胞，收集到離心管，離心，棄上清，加10 mL PBS重懸后離心重復3次以徹底洗去血清，用血小板計數器計數。加適量PBS重懸使細胞密度為1.5×109/L。將細胞轉入無菌EP管中，密封，置冰上，待移植。

3.8 MCAO后24 h股靜脈移植細胞 麻醉大鼠，固定，從股靜脈進針移植細胞，速度控制在1 mL/5 min左右(其中假手術組和PBS對照組移植1 mL PBS;hMSCs治療組移植1 mL hMSCs;轉基因治療組移植0.5 mL BDNF-hMSCs和0.5 mL GDNF-hMSCs細胞混合液;另移植EGFP-hMSCs 1 mL于3只正常大鼠和3只MCAO模型鼠。所有細胞密度都是1.5×109/L)。

3.9 體重變化及行為評估 從手術造模開始每天稱量大鼠體重。手術后3、5、7、10和14 d進行行為學測試。方法同訓練，貼附物移除實驗計時改為5 min，大于5 min按5 min計算，每天2次，中間間隔10 min以上;轉棒儀實驗參數設定為25 r/min 3 min，每天2次，間隔10 min以上。

3.10 灌注取腦觀察 2周后深度麻醉大鼠，打開胸腔腹腔充分暴露心臟，用注射器經心尖通過左心室插入主動脈，剪開右心耳后灌注生理鹽水250 mL左右至右心耳流出透明液體。換4%多聚甲醛液繼續灌注，出現肌顫后緩慢灌注至肝臟的顏色變白變硬，約灌注250mL。取出大腦，置4%多聚甲醛中固定1 d后觀察梗死區域并拍照。

3.11 HE染色觀察及腦梗死體積計算 將所有實驗組大鼠腦組織于4%多聚甲醛中固定1 d后將腦組織切成2 mm厚的5個冠狀切片(從松果體腺往嗅球方向每隔2 mm切1片)。將切片于4%多聚甲醛中固定2 d，做常規石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察，拍照。用圖像處理軟件處理圖像，測量切片梗死區域面積，計算腦梗死相對體積，參照 Neumann-Haefelin等的腦相對梗死體積百分比計算公式:各切片梗死面積=對側面積-梗死側非梗死區域面積;各切片梗死體積=切片兩面梗死面積之和×切片厚度/2;相對梗死體積百分比=各切片梗死體積之和/大腦體積。

3.12 振動切片觀察細胞遷移 取移植了EGFP-hMSCs大鼠的腦組織于4%多聚甲醛中固定1 d后將腦組織切成2 mm厚的5個冠狀切片(方法如前所述)。配4%瓊脂糖包埋各切片，于振動切片儀上進行切片，50 μm/片，然后將切片置于熒光倒置顯微鏡下觀察。

4 統計學處理

用SPSS 19.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 細胞的分離與體外擴增

采用我們自行研發的專利分離液分離hMSCs，體外培養使用培養基在傳統hMSCs培養基基礎上添加血小板源性生長因子、β-巰基乙醇和Vit C。此改良培養基培養細胞增殖較快，且傳代至第16代以上仍未見有細胞老化和分化跡象，優于傳統培養基，見圖1。取培養后的細胞做流式細胞術鑒定，結果表明培養第3代的hMSCs已經有了較高的純度，見圖2。

Figure 1.Effects of our self-made medium and traditional medium on hMSCs culture(×40).A:traditional medium;B:our self-made medium.圖1 自配改良培養基與傳統培養基培養hMSCs的效果比較

Figure 2.Flow cytometry analysis of the hMSCs(passage 3).圖2 第3代hMSCs的流式細胞術鑒定結果

2 細胞基因轉染修飾

將載體 pCAG-BDNF、pCMV-GDNF和 pEGFP-N2分別用Lipofectamine 2000轉染至hMSCs。轉染效率在70%左右，見圖3。通過ELISA檢測轉基因細胞上清液中的BDNF和GDNF表達量，結果非轉基因細胞和轉pEGFP-N2細胞表達量較少，轉入pCMV-GDNF和pCAG-BDNF細胞2種營養因子表達量遠大于非轉基因細胞和轉入載體pEGFP-N2的細胞，見表1。

Figure 3. The cell transfection rate 24 h after transfection(×40).圖3 脂質體轉染后24 h的細胞轉染率

表1 基因轉染對hMSCs BDNF和GDNF表達的影響Table 1.Effect of gene transfection on the expression of BDNF and GDNF in hMSCs(ng/L.Mean±SD.n=3)

3 細胞移植前后各組動物體重的變化

從大鼠體重下降到最低的時間和2周后動物體重恢復比例對其體重變化進行分析，結果轉基因組體重開始恢復的時間與PBS組相比顯著提前(P＜0.05)，平均開始恢復時間早于hMSCs組，體重在第14天能夠恢復到原體重的90%左右，顯著高于PBS對照組(P＜0.05)，平均體重恢復高于hMSCs組;hMSCs組平均體重開始恢復時間比PBS組早，14 d后平均體重恢復高于PBS組，但由于其組內差異比較大，hMSCs組體重變化與PBS組以及轉基因組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖4。

4 細胞移植前后各組動物行為學變化及腦梗死體積的比較

4.1 左腿貼附物移除時間 在第3天兩治療組貼附物移除時間要顯著短于PBS對照組(P＜0.05)，第5天后差異不顯著(P＞0.05)，說明干細胞能促進腦損傷大鼠較早期的身體機能恢復，見圖5。

4.2 右腿貼附物移除時間 轉基因組在第7天開始其右腿貼附物移除要顯著快于PBS對照組(P＜0.05)，平均時間比hMSCs組短;hMSCs組與PBS組相比在第14天有顯著改善(P＜0.05)，在其它時點平均時間比PBS組短;PBS組大鼠的貼附物移除時間2周內與假手術組相比明顯延長(P＜0.05)，而兩治療組從第5天開始貼附移除時間接近于假手術組(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 4.The changes of the body weight of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs PBS.圖4 各組大鼠體重的變化

Figure 5.Behavioral test and infarction volume analysis.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs PBS.圖5 行為學評估和腦梗死體積分析

4.3 轉棒儀跑步持續時間 從第10天開始轉基因組跑步能力顯著高于PBS組(P＜0.05)，其平均水平在所有時點均高于hMSCs組;hMSCs組平均跑步能力在所有時點均高于PBS組;PBS組與假手術組相比跑步能力一直未有顯著恢復(P＜0.05)，從第7天開始兩治療組與假手術組跑步差異不顯著(P＞0.05);hMSCs組組內差異比較大，其與PBS組以及轉基因組無顯著差異，見圖5。

4.4 腦梗死體積百分比 轉基因治療組腦梗死體積占總腦體積百分比(11.16% ±2.21%)比PBS組(15.42% ±1.34%)顯著縮小(P＜0.05)，平均值小于hMSCs組(13.95% ±3.21%);hMSCs治療組腦梗死體積平均值小于PBS組;hMSCs治療組組內差異較大，與PBS組以及轉基因組相比均無顯著差異，見圖5。

5 腦組織外觀及HE染色

5.1 腦外觀 (1)假手術組腦組織表面光滑完整;(2)PBS組腦組織表面粗糙，有一定程度的萎縮和較大面積的梗死區域;(3)轉基因治療組腦組織較為光滑，萎縮程度和梗死區域明顯減小;(4)hMSCs治療組治療效果組內差異較大，部分治療大鼠腦組織如轉基因治療組(4例)表現為梗死區域減小，部分治療大鼠腦組織(2例)與PBS組類似差異不明顯，見圖6。

5.2 HE染色 (1)假手術組腦組織細胞間緊密相連無梗死區域;(2)PBS組有較大面積梗死區域，梗死區域細胞稀疏排布;(3)轉基因組梗死區域面積較hMSCs組和PBS組小，梗死區細胞排布稀疏程度低;(4)hMSCs組有4例梗死區域比PBS組小，梗死區域細胞密度比PBS組大，也有2例其結果與PBS對照組相似，見圖6。

Figure 6.Infarct region obsrvation.In sham group，the surface of the rat brain was glossy and the cells of the brain were compact.In PBS group，the brain of the rats was rough and shriveled，and some interspaces between the cells in the infarct zone were observed.In hMSCs group，the rat brain also shriveled and there were some interspaces between the cells in the infarct area，but smaller than those in PBS group.In modified hMSCs group，the brain shriveled，infarct area was not significant，and the interspaces between the cells in the infarct area were the smallest in MCAO groups.圖6 腦梗死區域觀察

6 細胞遷移

通過GFP示蹤，我們在健康大鼠腦部和中風模型大鼠腦組織未梗死區域均未發現熒光細胞，僅在極少數切片的腦梗死區域發現少量綠色熒光細胞，見圖7。

討 論

Figure 7.Migration of the hMSCs.A:sham;B:PBS;C:hMSCs;D:modified hMSCs.At day 14 after hMSCs were injected to the MCAO rats through the femoral vein，the hMSCs migrated to the infarcted hemisphere.A few exogenous cells only survived in the infarct area of the brain in the MCAO rats and they had no differentiation.圖7 hMSCs在大鼠腦部的遷移

已有研究報道hMSCs腦室移植治療MCAO模型大鼠取得了良好的效果［12］。一些學者研究認為hM SCs移植治療MCAO模型大鼠效果與對照組相比無顯著差異，而用腺病毒介導BDNF或GDNF基因修飾的hMSCs移植治療MCAO模型大鼠有良好的效果［9-10］。然而其研究使用腺病毒載體，具有較大的臨床風險。本研究選擇非病毒高效表達載體并進行優化，用脂質體法介導基因修飾，與病毒載體相比更安全，有較好的臨床應用前景。

BDNF和GDNF是極為重要的神經營養因子，它們能夠為感覺神經元、運動神經元以及多巴胺神經元提供強大的營養支持作用，減少神經元凋亡并在神經元修復和結構重建過程中起重要作用［13］。目前研究表明當腦缺血后BDNF和GDNF的表達會受到影響［14］。本研究原擬進行雙基因修飾hMSCs，然而在實際中發現，雙基因修飾存在一定缺陷:雙基因修飾細胞并非能同時高表達兩種蛋白，其中一種蛋白表達會受到明顯抑制。因此本研究分別用單基因修飾干細胞，然后將二種干細胞混合用于移植治療。

本研究首次用脂質體介導BDNF基因修飾的hMSCs和GDNF基因修飾的hMSCs聯合股靜脈移植治療MCAO模型大鼠，跟PBS對照組相比，能促進神經功能恢復并且能有效減小腦梗死體積。而hMSCs治療組間差異大，效果不穩定，但綜合水平優于PBS組。這說明細胞轉入BDNF基因和GDNF基因能夠對腦中風模型有更有效、更穩定的治療效果。

我們采用綠色熒光蛋白示蹤，觀察靜脈移植的hMSCs，15 d后在大鼠腦組織中的存活以及遷移情況，發現只有少數的細胞在中風大鼠腦梗死區域中存活，未見分化現象。這說明在MSC靜脈移植治療中，神經元替換作用有限。BDNF和GDNF 2種重要的神經營養因子可加強了hMSCs的作用，說明營養因子在對抗神經損傷和在損傷后修復中起著重要作用。有研究報道，通過靜脈移植hMSCs至MCAO模型大鼠體內，第2天能夠在腦損傷區域檢測到較多的存活hMSCs，隨著時間的推移，細胞逐漸減少［15］。由此可見，細胞治療腦缺血病的作用機制可能是遷移到腦損傷區域，分泌多種營養因子對抗神經損傷和促進修復，而細胞本身受到機體免疫等相關機制的調節而逐漸死亡消失。

本研究首次用脂質體介導非病毒的BDNF基因修飾的hMSCs和GDNF基因修飾的hMSCs，通過股靜脈移植治療MCAO模型大鼠，與hMSCs相比有更好的治療效果。我國干細胞臨床研究管理辦法即將出臺，本研究中所使用的非病毒載體、脂質體轉染法以及靜脈移植均具有較大的臨床適用性，能夠為干細胞相關的基因治療腦血管病研究提供參考。

(致 謝:感謝中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究組各成員的指導和幫助!)

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