DENV2感染外周血單個核細胞增加TNF-α基因啟動子區域CpG位點的甲基化水平*

張英可， 張 林， 齊一鳴， 黃俊琪

(中山大學中山醫學院免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室，廣東廣州510080)

登革病毒(dengue virus，DENV)是一種重要的蚊媒病毒，能夠引起登革熱(dengue fever，DF)和重癥登革熱即登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)，重癥登革熱死亡率極高。最新文獻報道每年登革病毒感染人數約有39 000萬人［1］。Jaiyen等［2］指出DENV引起外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)凋亡，原因不僅在于病毒本身的毒性作用，也與產生的促炎因子腫瘤壞死因子 α(tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)有關。本課題組之前對細胞因子的研究發現，2型登革病毒(dengue virus type 2，DENV2)感染 PBMC 0 h、6 h 和 12 h，隨時間增加TNF-α 的產生減少［3］。

DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要組成部分之一，能夠通過影響轉錄因子的結合和染色體的結構引起基因表達抑制［4］。在脊椎動物中，DNA甲基化多發生在含高密度CpG雙核苷酸結構的CpG島區，但是TNF-α啟動子區不存在典型CpG島結構，僅有散在的CpG雙核苷酸［5］。TNF-α的表達調控受多種因素的影響，DNA甲基化修飾在這個過程中起重要作用。本研究通過在PBMC感染病毒后不同時間檢測TNF-α基因啟動子區域的甲基化水平，探討甲基化水平對該基因表達調控的影響。

材料和方法

1 材料

登革病毒2型 New Guinea C株(DENV2，NGC株)來自中山大學中山醫學院微生物學教研室，由本實驗室進行擴增和保存。健康人外周血由廣州市血液中心提供。RPMI-1640培養基和胎牛血清均購自Gibco。EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit購自 Qiagen。凝膠純化試劑盒購自Thermo。

2 方法

2.1 細胞分離培養 Ficoll Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，10%胎牛血清及1%青、鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基，37℃、5%CO2條件下培養。

2.2 登革病毒感染 DENV2進行擴增定量，病毒滴度為1×107pfu/L，以感染復數(multiplicity of infection，MOI)為1處理細胞，病毒吸附2 h后棄上清，加入含4%胎牛血清的培養基，于37℃、5%CO2條件下孵育6 h或12 h。

2.3 DNA甲基化轉化處理 取登革病毒感染0 h、6 h和12 h的細胞，分別提取DNA，使用EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit對各組DNA進行甲基化轉化。

2.4 PCR擴增 對各組甲基化轉化后的DNA進行擴增，設計亞硫酸氫鹽測序PCR甲基化檢測引物，正義鏈 5′-AGGGTTTTATATATAAATTAGTTAGTGGTTTAGAAGA-3′，反義鏈:5′-TATAATTACTTCTCTCCCTCTTAACTAATCCTC-3′，擴增產物大小為 353 bp(-294 bp～+58 bp)。PCR反應后取3 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析。對凝膠電泳后的各組DNA片段進行純化回收。

2.5 連接 目的片段 DNA 2 μL(約 150 ng)，PMD19-T 載體(TaKaRa)1 μL(約50 ng)，T4 快速連接酶 1 μL，10× Buffer用滅菌去離子水補足10 μL，22℃連接10 min。

2.6 轉化 取連接產物加到50 μL T1感受態細胞中，混勻，冰浴30 min;將上述轉化液置于42℃水浴30 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min;向其中加入900 μL 37℃預熱的LB培養基(不含抗生素)，150 r/min、37℃振蕩培養45 min;2 500 r/min離心5 min，將上清液吸走，留 100 μL混勻菌液，加到含AMP抗生素LB固體瓊脂培養基上(抗生素終濃度50 mg/L)，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細胞均勻涂開;待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養12～16 h。

2.7 基因測序 挑取上述平板上的單菌落，每組挑選5個克隆送中美泰和生物技術(北京)有限公司測序。

3 統計學處理

甲基化率以每組擴增序列發生甲基化的位點數占總甲基化位點數的百分率表示。各組間甲基化率差異的比較采用 χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 擴增序列

通過在線工具(http://www.urogene.org/methprimer/index1.html)預測甲基化位點，人工設計檢測引物。如圖1所示，箭頭所指為轉錄起始位點(transcriptional start site，TSS)，擴增序列為(-294 bp～+58 bp)，覆蓋11個甲基化位點。

Figure 1.The sequence of PCR product.The sequence was from-294 bp to+58 bp，including eleven CpG sites.The arrow indicated the transcriptional start site(TSS).圖1 擴增序列

2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定各樣本擴增產物

PCR反應結束后取各樣本3 μL PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示擴增產物的大小與理論相符合，見圖2。

3 硫化修飾后的TNF-α基因啟動子區域部分互補序列的測序結果

挑取上述平板上的單菌落，每組挑選5個克隆送測序公司測序。序列中未甲基化的C脫氨基變成U，而甲基化的C保持不變，見圖3。

4 TNF-α基因啟動子區域甲基化水平變化

基因測序結果顯示，TNF-α基因啟動子區域-294 bp到+58 bp區域內，11個甲基化位點中，DENV2感染PBMC 0 h和6 h有2個位點發生甲基化，感染12 h有6個甲基化位點發生甲基化，甲基化水平呈增高趨勢，見圖4。

感染0 h、6 h和12 h平均甲基化率分別為10.3%、12.1%和25.5%。0 h與12 h及6 h與12 h之間的甲基化率差異有統計學意義(P＜0.05)。

Figure 2.Identification of PCR product of each sample by agarose gel electrophoresis analysis.The size of PCR product was 353 bp，from-294 bp to+58 bp.The PCR products were consistent with the theoretical size.M:DL2000 DNA marker;1～9:PCR products of the samples.圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定各樣本擴增產物

Figure 3.Partial result of complementary sequence of bisulfite-converted TNF-α promoter region.Me-thylated loci were G and unmethylated loci were A in the complementary sequence because methylated C remained unchanged and unmethylated C turned into U，which was combined with A.圖3 硫化修飾的TNF-α啟動子區域部分互補序列測序結果

Figure 4.The changes of DNA methy-lation at CpG sites in the promoter region of TNF-α gene.The first and second sites were methylated at 0 h and 6 h，and the first，second，third，seventh，ninth and eleventh sites were methylated at 12 h.●:≥80%methylation at a given site in the sequencing of five individual clones;■○:between 20%and 80%methylation at a given site;○:≤20%methylation at a given site.圖4 TNF-α基因啟動子區域甲基化水平

討 論

目前登革熱的發病機制尚未完全明確，細胞因子風暴為重癥登革熱發病機制的相關假說之一［6］，登革病毒感染后多種細胞因子的水平會受到影響。Bozza等［7］的研究證實在重癥登革熱患者中IL-1、IL-4、IL-6、IL-13、IL-7 和 IFN-γ 等明顯增高，IL-1β、IL-8和TNF-α與血小板的減少有明顯的相關性。Wati等［8］發現TNF-α能夠通過多種機制誘導登革病毒感染的細胞發生凋亡。Jaiyen等［2］提出 DENV引起PBMC凋亡，除了病毒本身的毒性作用，也與產生的促炎因子TNF-α和IL-1β有關;他們還發現DHF患者TNF-α顯著高于DF患者，提示TNF-α在重癥登革病毒感染中起重要作用。TNF-α基因屬于早反應基因范疇，TNF-α蛋白呈現快速產生、早期分泌、快速下降的規律。有研究證實LPS刺激THP-1細胞TNF-α分泌在4 h達峰之后下降［9］。本課題組之前的研究發現正常人PBMC被DENV2感染0 h、6 h和12 h，隨時間增加 TNF-α 的產生減少［3］。這似乎提示了病毒初次感染與重癥感染的不同，可能是機體在初次病毒感染早期對自身的一種保護機制，避免重癥登革熱的發生。

TNF-α的表達調控受多種因素的影響，DNA甲基化修飾在這個過程中起重要作用。本研究采用亞硫酸氫鹽測序PCR法檢測TNF-α基因啟動子區的甲基化狀態，我們的結果表明病毒感染12 h TNF-α啟動子區域11個位點發生甲基化的水平明顯增加，感染6 h與0 h相比甲基化水平相當。我們之前的報道［3］，DENV2 感染 PBMC 0 h、6 h 和 12 h，隨時間增加TNF-α的產生減少。這種不同可能是由多因素共同調控 TNF-α的表達引起的。郭堯等［5］發現THP-1細胞在LPS刺激之前TNF-α啟動子區域的CpG雙核苷酸均處于甲基化狀態，而本實驗中PBMC在病毒感染0 h時就出現多個位點的去甲基化，這可能是細胞種類差異導致的不同。

本研究證明了PBMC在DENV2感染早期存在TNF-α基因甲基化水平的改變。甲基化能夠調控蛋白的表達，且TNF-α蛋白水平與登革熱病情的嚴重程度相關，這可能為治療或緩解登革病毒感染提供新的思路。

［1］ Bhatt S，Gething PW，Brady OJ，et al.The global distribution and burden of dengue［J］.Nature，2013，496(7446):504-507.

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［3］ Qi Y，Li Y，Zhang L，et al.MicroRNA expression profiling and bioinformatic analysis of dengue virus-infected peripheral blood mononuclear cells［J］.Mol Med Rep，2013，7(3):791-798.

［4］ Bergman Y，Cedar H.DNA methylation dynamics in health and disease［J］.Nat Struct Mol Biol，2013，20(3):274-281.

［5］ 郭 堯，楊智勇，王春友.啟動子區域甲基化狀態對THP-1細胞腫瘤壞死因子α分泌的影響［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1206-1209.

［6］ 黃俊琪.登革熱發病機制的研究進展［J］.實用醫學雜志，2011，27(19):3464-3465.

［7］ Bozza FA，Cruz OG，Zagne SM，et al.Multiplex cytokine profile from dengue patients:MIP-1β and IFN-γ as predictive factors for severity［J］.BMC Infect Dis，2008，8:86.

［8］ Wati S，Rawlinson SM，Ivanov RA，et al.Tumour necrosis factor alpha(TNF-α)stimulation of cells with established dengue virus type 2 infection induces cell death that is accompanied by a reduced ability of TNF-α to activate nuclear factor κB and reduced sphingosine kinase-1 activity［J］.J Gen Virol，2011，92(Pt 4):807-818.

［9］ 郭 堯.啟動子區域甲基化狀態與炎癥細胞TNF-α分泌關系及調控因素的研究［D］.武漢:華中科技大學，2011.