利用基因組比對方法尋找大腸桿菌DH1基因組中的非必需序列

虞劍，黃勇，周長林，童貽剛，方宏清

1.中國藥科大學 生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009；2.軍事醫學科學院 a.生物工程研究所；b.微生物流行病研究所；北京 100071

大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡便，培養條件簡單，大規模發酵經濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛、最成功的表達體系，常作為高效表達的首選體系。在大腸桿菌基因組中，存在一些非必需序列，這些序列的刪除不會對生物穩定性或基因產物造成不利影響。這些非必需序列包括插入序列元件、限制性修飾系統基因、破壞外源性DNA的核酸內切酶基因和一些鞭毛基因家族等[1]。插入序列元件的存在能夠影響基因組的穩定性。鞭毛負責細菌的運動，在工業生產和實驗室條件下，細菌的運動性對于細胞生產和生長來說并不是必需的，相反，這些鞭毛的存在增加了細胞的耗能，因此這些鞭毛基因也是可刪除的元件。Baba等[2]于2006發表了一項關于大腸桿菌基因必需性的研究結果，涉及絕大多數的大腸桿菌基因。他們構建了大批量單個基因缺失的突變株，對這些突變株進行檢測，結合遺傳足跡法、大腸桿菌染色體研究數據庫、系統的轉座子誘變法對大腸桿菌一系列基因必需性進行判定，對每個受檢測的基因給出了必需性評分，為大腸桿菌基因組研究提供了大量可參考信息。

細胞工廠，即一個可控性和可預料性更強的單元系統[3]。近年來，一些國家開始了構建細胞工廠的項目。第五次歐盟框架計劃執行了細胞工廠項目，期望構建的細胞工廠能在代謝工程領域有優異的表現。日本也在2001年啟動了最小化基因工廠（MGF）計劃，在該計劃中，一些模型微生物被遺傳改造，從而獲得基因組減小后的細胞，并期望構建的基因組最小化細胞能作為細胞工廠體系的理想平臺，已獲得一些典型的成果。如2002年，Kolisnychenko等[1]將大腸桿菌MG1655的基因組減小了8.1%，得到MDS12菌株，菌株的生長特性沒有發生改變；2006年，Posfai等[4]報道，他們完全刪除了大腸桿菌MG1655中的可移動元件，基因組減小率達15%，得到了MDS43菌株，其生長特性沒有發生改變，同時基因組穩定性得到了提高，使得電轉效率提高，并可表達一些毒素蛋白；2008年，Mizoguchi等[5]對大腸桿菌W3110進行了基因組連續刪減，使基因組減小了22%，得到菌株MFG-01，菌株的生長特性并沒有發生改變，同時提高了1.5倍的細胞密度，且改造后蘇氨酸的產量提高了2.4倍。除了關于基因組減小菌株在生長特性、細胞密度、電轉效率及產物表達能力等方面的報道外，在2005年Hashimoto[6]等發表的文章中，還提到了關于大腸桿菌基因組減小菌株在細胞形態學上的變化：基因組刪減菌株的細胞長度和寬度會發生改變，對基因組較大比例的刪減會使突變體細胞變得更長更寬，甚至一些表型會和球狀細胞類似。這一報道或許有助于一些未知基因功能的研究。本研究的目的是通過基因組比對的方法，確定實驗室常用的大腸桿菌DH1中的非必需序列，為構建基因組減小的大腸桿菌底盤細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株基因組序列

大腸桿菌DH1、MG1655、W3110全基因組序列及注釋來自GenBank。

1.2 大腸桿菌全基因組比對

利用軟件包Lasergene中的EditSeq軟件對查詢到的MG1655、W3110全基因組序列進行編輯，去除文獻[4-5]報道中的已敲除區域序列，將得到的基因序列 分 別 命 名 為 miniMG1655、miniW3110；通 過MAUVE軟件將DH1的基因組分別與miniMG1655、miniW3110的基因組進行比對，得到DH1基因組上多出的序列區域，稱為候選非必需區域。

1.3 大腸桿菌DH1基因組中非必需區域的篩選

為了避免因3株菌基因組的差異性而使必需序列被包含在候選非必需序列區域中，根據文獻中對大腸桿菌基因必需性和非必需性的研究[2,7]，評價候選非必需區域中所包含基因的必需性，從而篩選出包含非必需基因的序列區域，稱為大腸桿菌DH1基因組上的非必需區域。以文獻中單基因突變庫、遺傳足跡分析、大腸桿菌染色體研究數據庫、轉座子突變庫等對大腸桿菌基因必需性的評價結果為基礎，對于同一個基因，將4種評價體系的評分相加后得到一個總評分。總評分越低，對應基因的必需程度就越小；總評分越高，對應基因的必需程度就越大。

2 結果

2.1 大腸桿菌全基因組序列

根據文獻報道,從GenBank下載得到3種大腸桿菌的全基因組序列及其基因組注釋（表1）。

2.2 大腸桿菌基因組比對

通過軟件MAUVE對DH1與miniMG1655、miniW3110進行基因組比對，結果見圖1。可以直觀地看出，和miniMG1655、miniW3110相比，DH1基因組中有很多空白區，這些空白區即代表與對照基因組相比多余的序列區域。由于DH1、MG1655、W3110菌株間的同源性非常高，所以這些空白區基本都與文獻報道中miniMG1655、miniW3110的已敲除區域一致。我們將這些區域整理出來，與文獻中的敲除區序列進行比對分析，歸納并確定了大腸桿菌DH1中的候選非必需區域。

2.3 DH1基因組中非必需區域的確定

根據文獻[2]報道中大腸桿菌基因的必需性評分，對候選非必需區域中的基因進行必需性評價分析，以其中部分基因為例進行必需性評分，結果見表2，分數越低，表明基因的非必需性越高。在對所有候選非必需區域中的基因進行評分后，保留必需基因，并整理得到了64個非必需區域，結果見表3。

3 討論

細胞工廠作為一個全新的概念，在微生物領域漸漸嶄露頭角。更多的國家開始實施或計劃實施細胞工廠項目，因為得到一個好的細胞工廠，例如經基因組最小化改造的大腸桿菌MFG-01[5]，其遺傳的穩定性、對產物的高表達能力可以為工業化生產帶來全新的飛躍式發展。

大腸桿菌是最常用、研究最多的宿主菌，但在長期進化過程中攜帶了大量對細胞工廠底盤不必需的序列。這些序列導致大腸桿菌的遺傳不穩定，影響細胞工廠的效率及穩定性。將這些非必需序列刪除，構建遺傳穩定、背景干凈，并具有魯棒性（robust）代謝行為的底盤細胞，可以提高異源途徑的合成效率，提高目標產物的表達水平。這些優勢使得大腸桿菌成為構建細胞工廠的首選菌株。

表1 菌株編號、GI及基因組長度

圖1 大腸桿菌DH1和miniMG1655（上圖）、miniW3110（下圖）基因組比對圖

在大腸桿菌基因組減小的過程中，面臨的首要問題是確定非必需序列區域。需要對基因的必需性有充分的認識，才能合理選擇非必需序列區域。目前主要利用比較基因組學、功能基因組學和代謝網絡計算模擬等方法初步預測、分析識別必需基因及非必需基因，并結合單基因或多基因組合敲除試驗加以確證[8]。而隨著新基因的不斷發現，如新小分子蛋白質基因和小分子RNA基因的發現，使得非必需基因之間的區域是否都是非必需序列成為未知，所以通過非必需基因確定非必需序列區域具有一定的局限性。例如，目前在大腸桿菌中發現的小分子蛋白質扮演著多種角色，如yobF基因與菌株的耐酸能力相關[9]；blr基因可調節菌株對細胞膜壓力的敏感性[9]；ykgO基因受到鋅的抑制[10]，其編碼的蛋白YkgO可以在鋅缺失的條件下發揮核糖體功能[11]；rpmH編碼的小分子蛋白與內膜蛋白的嵌入相關[12]；還有一些基因組編碼的小分子蛋白質，在高濃度時表現出細胞毒性，如ShoB蛋白[13]。由于已知小分子蛋白質的功能多樣性，且在大腸桿菌中還存在許多未知功能的小分子蛋白質，所以在大腸桿菌基因組改造過程中，必須考慮到編碼小分子蛋白質基因對改造目的的影響。

表2 候選非必需區域中基因的必需性評價

在本研究中，由于大腸桿菌DH1、MG1655、W3110菌株基因組的同源性非常高，故參考MG1655、W3110非必需區域刪減的相關文獻，通過軟件MAUVE進行基因組比對，得到類似的候選非必需區域，縮小了非必需區域篩選范圍，然后根據大腸桿菌非必需基因的文獻報道確定了DH1基因組上64個非必需區域。這為后續利用實驗室成熟的Red同源重組技術[14]構建基因組最小化的底盤細胞miniDH1提供了基礎。

表3 大腸桿菌DH1基因組中的非必需區域

[1]Kolisnychenko V,Plunkett G,Herring C D,et al.Engineer?ing a reduced Escherichia coli genome[J].Genome Res,2002,12(4):640-647.

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