氣相色譜—質譜聯用選擇離子監測方法定量分析低濃度胞內游離氨基酸的13C同位素豐度

李敏超+黃明志+劉玉偉等

摘要：胞內游離氨基酸具有周轉快的特點，其13C同位素豐度能快速反映胞內代謝狀態的變化。但胞內游離氨基酸的濃度很低，現有的基于氣相色譜質譜聯用全掃描模式的13C同位素豐度檢測方法不能滿足要求。本研究考察理論上檢測精度更高的選擇離子監測方法在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中應用的可能性。首先在全掃描模式下分析了不同氨基酸的斷裂規律，找出與每種氨基酸對應的特征碎片，建立起包含有16種胞內游離氨基酸的特征碎片庫。利用此特征碎片庫，在樣品分析時只需檢測特定m/z處的信號，從而實現選擇離子監測，提高信號質量。對標準品的檢測結果表明，與全掃描模式相比，本方法的信噪比、測量精度和準確性分別提高了17倍、2倍和3.8倍。在對輔酶Q10生產菌株樣品的分析中，本方法成功檢測出8種胞內游離氨基酸的同位素豐度。

關鍵詞：選擇離子監測； 13C同位素豐度； 氣相色譜質譜聯用； 游離氨基酸

1引言

13C代謝流分析技術（13CMFA）作為研究細胞生理代謝分布的重要工具，被廣泛應用于各類細胞代謝、調控機制研究，其中13C同位素體豐度準確測定是進行13C代謝流計算的關鍵步驟[1～4]。13C同位素示蹤技術是細胞利用13C同位素作為碳骨架，通過不同代謝途徑，研究細胞代謝物的13C同位素分布差異。因此開展準確測定胞內游離小分子化合物13C同位素豐度分布對研究細胞生理代謝具有重要意義。

由于細胞內氨基酸等小分子物質本身濃度較低，基于全掃描模式的氣相色譜質譜聯用（GC檢測方法不能滿足測定游離氨基酸要求，因此，本研究考察了理論上檢測精度更高的選擇離子檢測方法在準確在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中的可能性。雖然GCMS測定水解蛋白質的氨基酸的13C同位素體已有報道[5～7]，但是直接用于檢測胞內自由氨基酸13C同位素豐度的方法未見報道[8]。本研究首先在GCMS全掃描模式下，通過對氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片庫；并在此基礎上采用選擇離子模式（SIM）方法，測定自然標記下氨基酸13C同位素豐度；通過測定輔酶Q10生產菌株的實際樣品中游離氨基酸13C同位素豐度，進行比較分析。

摘要：胞內游離氨基酸具有周轉快的特點，其13C同位素豐度能快速反映胞內代謝狀態的變化。但胞內游離氨基酸的濃度很低，現有的基于氣相色譜質譜聯用全掃描模式的13C同位素豐度檢測方法不能滿足要求。本研究考察理論上檢測精度更高的選擇離子監測方法在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中應用的可能性。首先在全掃描模式下分析了不同氨基酸的斷裂規律，找出與每種氨基酸對應的特征碎片，建立起包含有16種胞內游離氨基酸的特征碎片庫。利用此特征碎片庫，在樣品分析時只需檢測特定m/z處的信號，從而實現選擇離子監測，提高信號質量。對標準品的檢測結果表明，與全掃描模式相比，本方法的信噪比、測量精度和準確性分別提高了17倍、2倍和3.8倍。在對輔酶Q10生產菌株樣品的分析中，本方法成功檢測出8種胞內游離氨基酸的同位素豐度。

關鍵詞：選擇離子監測； 13C同位素豐度； 氣相色譜質譜聯用； 游離氨基酸

1引言

13C代謝流分析技術（13CMFA）作為研究細胞生理代謝分布的重要工具，被廣泛應用于各類細胞代謝、調控機制研究，其中13C同位素體豐度準確測定是進行13C代謝流計算的關鍵步驟[1～4]。13C同位素示蹤技術是細胞利用13C同位素作為碳骨架，通過不同代謝途徑，研究細胞代謝物的13C同位素分布差異。因此開展準確測定胞內游離小分子化合物13C同位素豐度分布對研究細胞生理代謝具有重要意義。

由于細胞內氨基酸等小分子物質本身濃度較低，基于全掃描模式的氣相色譜質譜聯用（GC檢測方法不能滿足測定游離氨基酸要求，因此，本研究考察了理論上檢測精度更高的選擇離子檢測方法在準確在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中的可能性。雖然GCMS測定水解蛋白質的氨基酸的13C同位素體已有報道[5～7]，但是直接用于檢測胞內自由氨基酸13C同位素豐度的方法未見報道[8]。本研究首先在GCMS全掃描模式下，通過對氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片庫；并在此基礎上采用選擇離子模式（SIM）方法，測定自然標記下氨基酸13C同位素豐度；通過測定輔酶Q10生產菌株的實際樣品中游離氨基酸13C同位素豐度，進行比較分析。

摘要：胞內游離氨基酸具有周轉快的特點，其13C同位素豐度能快速反映胞內代謝狀態的變化。但胞內游離氨基酸的濃度很低，現有的基于氣相色譜質譜聯用全掃描模式的13C同位素豐度檢測方法不能滿足要求。本研究考察理論上檢測精度更高的選擇離子監測方法在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中應用的可能性。首先在全掃描模式下分析了不同氨基酸的斷裂規律，找出與每種氨基酸對應的特征碎片，建立起包含有16種胞內游離氨基酸的特征碎片庫。利用此特征碎片庫，在樣品分析時只需檢測特定m/z處的信號，從而實現選擇離子監測，提高信號質量。對標準品的檢測結果表明，與全掃描模式相比，本方法的信噪比、測量精度和準確性分別提高了17倍、2倍和3.8倍。在對輔酶Q10生產菌株樣品的分析中，本方法成功檢測出8種胞內游離氨基酸的同位素豐度。

關鍵詞：選擇離子監測； 13C同位素豐度； 氣相色譜質譜聯用； 游離氨基酸

1引言

13C代謝流分析技術（13CMFA）作為研究細胞生理代謝分布的重要工具，被廣泛應用于各類細胞代謝、調控機制研究，其中13C同位素體豐度準確測定是進行13C代謝流計算的關鍵步驟[1～4]。13C同位素示蹤技術是細胞利用13C同位素作為碳骨架，通過不同代謝途徑，研究細胞代謝物的13C同位素分布差異。因此開展準確測定胞內游離小分子化合物13C同位素豐度分布對研究細胞生理代謝具有重要意義。

由于細胞內氨基酸等小分子物質本身濃度較低，基于全掃描模式的氣相色譜質譜聯用（GC檢測方法不能滿足測定游離氨基酸要求，因此，本研究考察了理論上檢測精度更高的選擇離子檢測方法在準確在胞內游離氨基酸13C同位素豐度分析中的可能性。雖然GCMS測定水解蛋白質的氨基酸的13C同位素體已有報道[5～7]，但是直接用于檢測胞內自由氨基酸13C同位素豐度的方法未見報道[8]。本研究首先在GCMS全掃描模式下，通過對氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片庫；并在此基礎上采用選擇離子模式（SIM）方法，測定自然標記下氨基酸13C同位素豐度；通過測定輔酶Q10生產菌株的實際樣品中游離氨基酸13C同位素豐度，進行比較分析。