電解蝕刻法處理的鈦及鈦合金表面的對比研究

王世振　孟維艷　矯國田　等

[摘要] 目的 通過成骨細胞的體外培養，初步探討鈦及鈦合金微-納米三維形貌對成骨細胞生物學行為的影響。方法 采用電解蝕刻法在純鈦及鈦合金表面構建出不同尺寸的微-納米三維形貌，并觀察其三維結構表面對成骨細胞黏附、增殖、細胞形態、堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。結果 在成骨細胞的黏附和增殖方面，純鈦組和鈦合金組表面均高于純鈦機械拋光組。純鈦組表面細胞胞體飽滿，伸出大量偽足，并可見大量功能顆粒。ALP活性顯著高于鈦合金和純鈦機械拋光組表面。結論 通過電解蝕刻法在純鈦和鈦合金表面可形成不同直徑和深度的碗形巢樣及納米結構；兩個表面即30～50 μm和5～8 μm的表面和光滑表面相比，都明顯促進了細胞的附著；30～50 μm的純鈦表面更有利于促進細胞的增殖和分化。

[關鍵詞] 純鈦； 鈦合金； 種植體； 成骨細胞； 生物學行為； 電解蝕刻

[中圖分類號] R 783.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.016

純鈦及鈦合金以其良好的機械性能和生物相容性，可與骨組織形成骨結合，作為人工種植體被廣泛應用于口腔種植領域。研究[1]證實鈦及鈦合金種植體表面特性影響骨整合率，尤其表面形貌影響成骨細胞的生物學行為及功能狀態。目前對種植體表面形貌的研究主要集中在微米形貌和納米形貌兩個方面。研究[2]認為微米形貌能增強機械固位，促進成骨細胞的黏附、分化和細胞外基質的形成和礦化，改變蛋白的構象，促進成骨細胞的定向、黏附、增殖，提高骨整合率。但Meirelles等[3]認為僅有納米形貌是不足以保證骨整合的，微米形貌對骨整合也非常重要。因此兼具有微納米三維結構的種植體表面成為未來發展的趨勢及研究的熱點。本研究采用電解蝕刻法（electrolytic etching，EE）在純鈦及鈦合金表面構建出微-納米三維形貌，研究成骨細胞在兩種金屬表面的不同生物學行為，初步探討了純鈦及鈦合金微納米三維結構表面對成骨細胞黏附、增殖、細胞形態、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司，美國），胰蛋白酶、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、乙二胺四乙酸鈉（ethylenediamine tetraace-tic acid，EDTA）（Merke公司，西德），ALP檢測試劑盒（南京建成生物生物工程研究所），圓柱形的純鈦及鈦合金試件（沈陽中航鈦業公司）。JSM-

6700場發射掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）、HHW21.420電解儀及電解槽（自制）、Allegra X-12臺式離心機、UV-260紫外可見光分光光度計（Beckman公司，美國）。

1.2 純鈦及鈦合金粗化表面的構建

采用EE法處理圓柱形的純鈦和鈦合金試件（直徑為4 mm×10 mm）底面，以鈦為陽極，鉑片為陰極，酸為電解液，在一定時間和電流作用下對金屬表面進行蝕刻，獲得兼具有微-納米三維形貌的表面。在距電解蝕刻處理面約2 mm處切割，形成直徑為4 mm×2 mm試件。試件的一面為電解蝕刻面，另一面是切割形成的表面。實驗分為純鈦組（EE1）、鈦合金組（EE2）、純鈦機械拋光組（M組）。將上述3組試件用丙酮、無水乙醇、去離子水分別超聲清洗10 min，干燥塑封，高壓鍋滅菌消毒，備用。

1.3 兩種表面的成骨細胞生物學行為

1.3.1 MG-63細胞培養 37 ℃，5%CO2和100%飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清、60 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1鏈霉素的DMEM全營養培養基培養MG-63細胞。在玻璃培養瓶中加入0.25%胰酶后離心，收集細胞，加入細胞凍存液（含70%培養液、20%胎牛血清和10%二甲基亞砜混勻。置于4 ℃條件下40 min，-20 ℃條件下2 h，然后置于-70 ℃過夜，最后置于液氮中，長期保存。

1.3.2 兩種不同表面的MG-63細胞增殖能力 將經過EE法處理的純鈦及鈦合金試件經過高溫、高壓消毒后，放入到已消毒的96孔培養板中，每孔放置1個試驗件，以正常組為對照。用0.25%胰蛋白酶將對數期的MG-63細胞制成單細胞懸液，加入96孔培養板。每孔0.1 mL，每個實驗組設6復孔。分別于第1、3、5、7天取出一塊板后每孔加入10 μL MTT（5 g·L-1）溶液后繼續培養4 h，吸出原培養液后每孔加入二甲基亞砜150 μL，室溫下振蕩器振蕩15 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀測定各孔吸光度（A）值，實驗波長為490 nm，按照公式計算細胞增殖率，細胞增殖率=（An-A0）/A0，An為某時間點的A值，A0為1 d時A值（設為基礎值）。

1.3.3 不同表面對MG-63細胞貼壁率的影響 將3組試件放到24孔培養板中，每孔放置10個試件，設3復孔。將0.25%胰酶消化后的細胞制成細胞懸液，每孔放入懸液1 mL，細胞濃度為每孔1×105個，以正常組為對照。細胞接種后分別在1、2、6、12、24 h終止培養，0.01 mol·L-1的PBS輕輕沖洗試件3次后，轉入另一個24孔培養板中，每孔加0.3 mL 0.25%胰酶消化3 min，加0.7 mL含10%胎牛血清的DMEM終止消化，輕輕吹打實驗件，制成單細胞懸液，臺盼蘭染色，顯微鏡下計細胞數，按照公式計算細胞貼壁率，細胞貼壁率=（貼壁細胞數/接種細胞數）×（培養孔底面積/鈦試驗件表面積）×100%。

1.3.4 不同表面對MG-63細胞形態的影響 將3組試件放入到已消毒的96孔培養板中，每孔放置1個試件，設6復孔，以正常組為對照。將培養瓶內對數期生長的細胞以0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，每孔加入0.l mL，接種后在第1、3、5天終止培養，0.01 mol·L-1的PBS輕輕沖洗3次；2.5%戊二醛固定過夜后，0.1 mol·L-1 PBS沖洗3次，每次15 min；1%鋨酸固定60 min，0.1 mol·L-1 PBS沖洗3次，每次15 min；分別以50%、70%、80%、90%、100%乙醇依次脫水各15 min；100%乙酸異戊酯處理15 min，干燥；經黏臺，噴金后SEM觀察。

1.3.5 不同表面對ALP活性的影響 將3組試件放入到已消毒的24孔培養板中，每孔放置10個試驗件，設3復孔，以正常組為對照。將培養瓶內對數期生長的細胞以0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，每孔加入

l mL，細胞接種后分別在第1、3、5、7天終止培養。用超聲破裂細胞，每次10 s，共3次，冰上操作，將細胞液轉移到1.5 mL的EP管內，此時的ALP為細胞內和培養上清內ALP。

1.4 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對實驗數據進行分析，均數兩兩比較采用單因素方差分析檢驗。

3 討論

種植體表面特性可驅動成骨細胞活性[4]，特別是表面微觀幾何形貌影響種植體和成骨細胞相互作用，并因此引導隨后的細胞反應。體外研究[5]證實，鈦表面形貌影響細胞和生物材料相互作用如細胞的附著、增殖和分化。細胞的附著和黏附與整合素受體有關，整合素受體（穿膜蛋白）其亞單位（β1-整合素）是成骨細胞重要的黏附分子，在細胞附著和伸展過程中起關鍵作用[6]。當整合素和成骨細胞合成的細胞外基質蛋白（纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原蛋白）結合，形成黏著斑，把細胞骨架和細胞外基質蛋白粘接在一起，使細胞黏附于材料表面[7]。整合素與基質蛋白的粘接激活了信號傳遞系統，將表面形貌信號傳遞到細胞內直到細胞核。此信號能調節細胞形狀、遷移、增殖、分化及基因表達[8]。細胞黏附后，整合素活化不僅影響信號傳導和轉錄因子的表達，還影響細胞骨架的結構排列，從而影響細胞的形態和伸展。與整合素連接的肌動蛋白在表面信號的驅動下重新分布、排列，驅使細胞漿前移使細胞伸展、形態改變[9]。不同的表面整合素亞單位反應及表達方式不同，局部動力不同，因而細胞形狀、伸展和轉錄分子的表達不同。本研究中，3種表面在最初的1～2 h，EE2組試件表面的黏附率高于EE1組和M組，M組最低，差異有統計學意義。但在隨后的6～12 h，EE1組略高于EE2組，但差異無統計學意義。兩組都明顯地高于M組。說明粗糙的表面比光滑表面更有利于細胞的黏附。在這里微米凹尺寸的大小對于細胞的附著沒有明顯的影響。從細胞的增殖結果可見，純鈦表面的細胞增殖高于鈦合金表面，尤其在第7天出現顯著的差異。兩者表面的細胞增殖又明顯高于機械表面，說明30～50 μm的碗型微米凹比5～8 μm直徑的碗型凹，更有利于細胞的增殖。兩個表面的碗型凹內都具有納米結構，促進了細胞的增殖。但30～50 μm的凹促進作用更為明顯，可能與其暴露更多的納米結構有關。此外，這種碗型巢可使纖維蛋白血凝塊在種植體表面穩定沉積，并使脆弱的細胞外基質支架固定，從而形成穩定的微環境，有利于細胞沿著纖維蛋白支架向種植體表面遷移和生長，使細胞形態發生變化。此外，從細胞形態變化可見，30～50 μm凹的純鈦表面上的細胞胞體巨大、飽滿，偽足粗壯，牢牢附著在碗型凹側壁和邊緣，伸展充分，表面具有大量的分泌顆粒和線粒體一樣的結構，說明30～50 μm的充滿納米結構的“納米巢”，可使細胞處在最佳的活性和功能狀態。

ALP是參與骨形成的重要物質，是成骨細胞分化的重要標志物。純鈦表面的ALP活性明顯高于鈦合金表面和機械表面，這與細胞的活性和功能狀態密切相關，說明30～50 μm碗型凹的粗糙表面更能刺激成骨細胞的功能，促進其分化。

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（本文編輯 杜冰）